西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院 （西安710004） 石建峰 饒國洲 魏 虹 張 晨 李 昂

骨形成蛋白（BMPs）是一類具有多種功能的生長因子，屬于轉(zhuǎn)化生長因子β超家族，具有明顯促成骨作用的細胞因子，參與機體胚胎發(fā)育、骨骼形成及組織器官發(fā)生等生命過程。人骨形成蛋白7（Human bone morphogenetic protein－7，hBMP7）是其中促成骨作用較強的一個成員，具有較強的骨誘導(dǎo)能力及維持軟骨細胞的表型、促進細胞外基質(zhì)如蛋白多糖和Ⅱ型膠原的合成、促進有成骨作用的細胞分化等能力，在體內(nèi)外均能誘導(dǎo)形成骨組織、牙本質(zhì)，不僅可實現(xiàn)牙槽骨的再生，還可明顯提高牙骨質(zhì)再生量，是組織工程技術(shù)常用的一種細胞因子［1］。

基因轉(zhuǎn)移載體的選擇，決定著治療基因能否進入種子細胞并實現(xiàn)有效表達，是基因治療和組織工程技術(shù)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。重組腺相關(guān)病毒［2］（Recombinant adeno－associated virus carrierr，rAAV）宿主范圍廣，既能感染分裂期細胞也能感染非分裂期細胞；能將其基因組DNA定點整合到宿主細胞染色體上，使攜帶的外源基因在宿主體內(nèi)持續(xù)穩(wěn)定表達，且不引起宿主基因突變。以rAAV為基礎(chǔ)構(gòu)建的病毒載體，已經(jīng)在科學(xué)研究領(lǐng)域及多種疾病的基因治療方面得到了廣泛的應(yīng)用。

本組擬利用前期構(gòu)建并鑒定正確的腺相關(guān)病毒載體pAAVIRES－h(huán)rGFP－h(huán)BMP7［3］，應(yīng)用 AAV Helper－Free System、磷酸鈣三質(zhì)粒共沉淀法，在AAV－293細胞內(nèi)包裝具有感染性的腺相關(guān)病毒rAAV－h(huán)BMP7，按氯仿處理、PEG／NaCL沉淀的方法濃縮純化；并測定其包裝效率及感染AAV－HT1080細胞后的感染效率和滴度，為組織工程技術(shù)治療牙周組織缺損做基礎(chǔ)性研究。

材料與方法

1 試驗材料 AAV Helper－Free System、AAV－293細胞、AAV－HT1080細胞、pAAV－GFP質(zhì)粒、胎牛血清、L－DMEM 培養(yǎng)基、H－DMEM 培養(yǎng)基購自美國Stratagene公司；高純度質(zhì)粒大提試劑盒購自北京TIANGEN公司；磷酸鈣法細胞轉(zhuǎn)染試劑盒、β－半乳糖苷酶原位染色試劑盒購自碧云天（Beyotime）公司；氨芐青霉素、鏈霉素購自北京奧科；其余試劑為國產(chǎn)分析純。

2 實驗方法

2．1 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 制備含 Amp（50μg／m1）的LB固體平板，流水下快速解凍DH5α感受態(tài)細胞，加入1 μl pAAVIRES－h(huán)rGFP－h(huán)BMP7質(zhì)粒，輕輕旋轉(zhuǎn)混勻，冰浴30min；42℃熱休克90s；冰浴2min，加入預(yù)熱至37℃的LB液體培養(yǎng)基400μl，37℃，搖床轉(zhuǎn)速＜50r／min溫育45min，使細胞復(fù)蘇并表達質(zhì)粒編碼的抗性基因；取100μl菌液涂于含X－gal和IPTG的瓊脂平皿，于37℃培養(yǎng)16～18h；終止培養(yǎng)后，將平板置4℃冰箱1～4h，使藍白斑篩選實驗充分顯色。同法對輔助質(zhì)粒pAAV－Helper和包裝質(zhì)粒pAAV－RC進行轉(zhuǎn)化。

2．2 質(zhì)粒大量提取及濃度和純度測定 每種質(zhì)粒隨機挑取3個轉(zhuǎn)化陽性克隆（白色克?。?，各加入到5 ml LB液體培養(yǎng)基中（含 Amp 50μg／ml），37℃、225 r／min震蕩培養(yǎng)3h，分別加入到裝有250ml LB液體培養(yǎng)基（含 Amp 50μg／ml）的500ml三角燒瓶中，37℃、225r／min震蕩培養(yǎng)過夜，測A600處OD值＞0．60，質(zhì)粒大提試劑盒提取質(zhì)粒，進行濃度和純度測定。用BamHI／SalI雙酶切鑒定重組病毒質(zhì)粒pAAVIRES－h(huán)rGFP－h(huán)BMP7。

2．3 AAV－293細胞培養(yǎng) 在37℃水浴中快速解凍AAV－293細胞，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到裝有10mlDMEM培養(yǎng)液的錐底離心管中，室溫下以200g的速度離心3min吸除上清液，重新加入5ml新鮮DMEM輕輕吹打重懸細胞，轉(zhuǎn)移到一個裝有10mlDMEM（氨芐青霉素100U／ml和鏈霉素100μg／ml）的75cm的組織培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。細胞生長至50%融合時傳代培養(yǎng)。

2．4 三質(zhì)粒共沉淀法AAV－293細胞包裝rAAV－h(huán)BMP7 將AAV－293細胞種植于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，3×105／孔，培養(yǎng)至70～80%融合。采用AAV Helper－Free System／磷酸鈣三質(zhì)粒共沉淀法轉(zhuǎn)染AAV－293細胞（以下為每孔加液量）。轉(zhuǎn)染前30～60min，吸去培養(yǎng)液，加入新鮮的不含抗生素的DMEM完全培養(yǎng)液4ml。分別取純度1．80以上的pAAV－Helper、pAAVIRES－h(huán)rGFP－h(huán)BMP7 和 pAAV－RC 各 10μl（1μg／μl），加入到 100μl氯化鈣溶液中混勻，對照組以pAAV－GFP代替病毒質(zhì)粒。把DNA－氯化鈣溶液加入到100μl BBS溶液中混勻，室溫孵育20min均勻滴加到整個孔內(nèi)。實驗組10孔，對照組1孔，陰性對照1孔／板。37℃，5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12h后輕輕晃動培養(yǎng)板數(shù)次，吸去含磷酸鈣沉淀的培養(yǎng)液，加入2ml新鮮的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)72h，收集細胞，期間倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)及熒光表達情況。

病毒包裝完成后，取平行對照rAAV－GFP組細胞培養(yǎng)皿，倒置熒光顯微鏡下隨機選取高倍視野下（400×）10個視野，計數(shù)視野內(nèi)表達熒光細胞數(shù)量及細胞總數(shù)計算rAAV－h(huán)BMP7的包裝效率。

2．5 病毒液的收集和純化 用細胞刮刀把貼壁細胞全部刮落到培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)移到一消毒、預(yù)冷的50ml離心管中，反復(fù)凍融四次（干冰浴和37℃水?。?，每次凍和融的時間為10min左右。每次融化后輕輕漩渦振蕩離心管。12000r／min離心10min除去細胞碎片。將含病毒的上清轉(zhuǎn)入一新的試管中。

向病毒液中（40ml）加入1／10體積的氯仿，37℃，300rpm／min劇烈振搖1h。加入固體氯化鈉2．56g至終濃度為1mol／L，4℃、12000r／min離心30min，收集上清于一新的50ml離心管中，加入PEG8000 4．5g至終濃度10%，劇烈振搖直至完全溶解，冰浴1h。4℃，12000r／min離心30min棄上清，4ml PBS溶解沉淀，以每份0．5ml分裝在1．5ml EP管中，–80℃保存。命名為rAAV hBMP7。

2．6 rAAV hBMP7感染 AAV－HT1080細胞將AAV－HT1080細胞復(fù)蘇及傳代培養(yǎng)（方法和步驟同AAV－293細胞的復(fù)蘇與傳代）。用L－DMEM調(diào)節(jié)細胞密度為1．5×105／ml，種植于12孔培養(yǎng)板，每孔1ml，37℃培養(yǎng)至70%融合。每孔加0．2ml AAV Permissive Growth Medium，（保留最初的培養(yǎng)液），漩渦振蕩混合細胞，37℃孵育5～6h 吸除孔內(nèi)液體，用37℃預(yù)溫的L－DMEM 洗滌細胞1次。用L－DMEM將純化的病毒原液0．1ml按10×的濃度梯度稀釋為10－2，10－3，10－4，10－5，10－6。分別加入各培養(yǎng)孔，每濃度組設(shè)3孔，每孔0．5ml，在37℃孵育培養(yǎng)板2h，其間每30min輕輕漩渦振蕩培養(yǎng)板幾次。各加0．5ml預(yù)溫的H－DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)48h。期間倒置顯微鏡和熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及熒光表達情況。

2．7 β－半乳糖苷酶染色法測定rAAV hBMP7感染效率和滴度 AAV－HT1080細胞培養(yǎng)至48h，吸出培養(yǎng)液，用L－DMEM洗滌細胞一次，原位β－半乳糖苷酶染色試劑盒固定并染色細胞。每孔加0．5mlβ－半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定10min；吸除固定液，用PBS洗滌細胞3次，每次3min；每孔加入0．5ml染色工作液（10μlβ－半乳糖苷酶染色液 A ＋10μlβ－半乳糖苷酶染色液B＋930μlβ－半乳糖苷酶染色液C＋X－Gal溶液50μl）；37℃孵育20min至2h，直至部分細胞顏色變藍。顯微鏡下觀察并計數(shù)一定細胞中藍色細胞的個數(shù)，計算rAAV hBMP7感染效率，感染效率＝染色陽性細胞數(shù)／計數(shù)細胞總數(shù)×100%，并估算病毒原液感染滴度。

結(jié) 果

1 質(zhì)粒濃度和純度 提取的pAAVIRES－h(huán)rGFP－h(huán)BMP7質(zhì)粒，經(jīng)紫外分光光度儀檢測，在260nm處OD值為0．56，OD260／OD280＝1．79；OD260值為1．0相當(dāng)于大約50μg／ml雙鏈DNA，質(zhì)粒稀釋倍數(shù)為40，計算得質(zhì)粒濃度為1．12mg／ml（1．12μg／μl）。同法計算包裝質(zhì)粒pAAV－RC的濃度為1．08μg／μl，純度為1．81；輔助質(zhì)粒pAAV－Helper濃度為1．22μg／μl，純度為1．82，純度和濃度均符合后繼實驗要求。

2 pAAVIRES－h(huán)rGFP－h(huán)BMP7雙 酶切 鑒 定 用BamHI／SalI雙酶切重組病毒質(zhì)粒pAAVIRES－h(huán)rG FP－h(huán)BMP71．2%瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示6100bp和1300bp區(qū)域有兩條DNA條帶（見圖1），與病毒載體 質(zhì) 粒 pAAVIRES－h(huán)rGFP（6．1Kb）及 目 的 基 因hBMP7（1296bp）大小一致。雙酶切圖譜說明所提質(zhì)粒為前期構(gòu)建并鑒定的質(zhì)粒pAAVIRES－h(huán)rGFP－h(huán)BMP7。

3 rAAV hBMP7在293細胞內(nèi)的包裝

3．1 包裝6h細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和熒光表達情況 病毒包裝6h后，倒置顯微鏡低倍下觀察可見rAAVGFP組、rAAV－h(huán)BMP7組AAV－293細胞形態(tài)正常、生長狀態(tài)良好。提示磷酸鈣共沉淀物對AAV－293細胞生長干擾較小，底部可見少量細小的顆粒，為殘余的磷酸鈣共沉淀物；高倍鏡下觀察AAV－293可見細胞漿中含有較多極細小的磷酸鈣顆粒（見圖2）。倒置熒光顯微鏡觀察，陰性組無熒光，rAAV－GFP組和rAAV－h(huán)BMP7組均出現(xiàn)熒光表達，以對照rAAV－GFP組為明顯（見圖3）。提示病毒在293細胞內(nèi)已經(jīng)獲得“拯救”、包裝，并隨細胞的分裂而復(fù)制，報告基因也已經(jīng)開始表達。

圖1 質(zhì)粒pAAVIRES－h(huán)rGFP－h(huán)BMP7雙酶切圖M：DNA MakerⅥ，1：BamHI／SalI 雙酶切

圖2 包裝6h后AAV－GFP組倒置顯微鏡下AAV－293細胞表型變化（A：100×；B：400×）

圖3 包裝12h后AAV－GFP組熒光表達（A：普通倒置顯微鏡；B：倒置熒光顯微鏡；400×）

3．2 包裝72h觀察 陰性組始終無熒光發(fā)出（圖4A，D），隨培養(yǎng)時間延長，rAAV－GFP組（見圖4 B，E）和rAAV－h(huán)BMP7（見圖4C，F(xiàn)）組培養(yǎng)基顏色逐漸變?yōu)樽攸S色，板底細胞表面有沉淀物形成，上清中也有大量絮狀物出現(xiàn)，細胞形態(tài)變的不規(guī)則，有相互融合的趨勢。兩組細胞表達熒光的細胞數(shù)量及熒光強度也隨包裝時間延長而增加，72h時絕大多數(shù)細胞都發(fā)熒光。各組細胞同一視野下形態(tài)結(jié)構(gòu)及熒光表達情況見圖4。

3．3 包裝效率 病毒包裝完成后，取平行對照rAAV－GFP組細胞培養(yǎng)皿，倒置熒光顯微鏡下隨機選取高倍視野下（400×）10個視野，計數(shù)視野內(nèi)表達熒光細胞數(shù)量及細胞總數(shù)，取平均值計算rAAV－h(huán)BMP7包裝效率為94．16±0．13%。

圖4 包裝72h倒置顯微鏡下AAV－293細胞表型變化及倒置熒光顯微鏡下GFP表達

4 rAAV－h(huán)BMP7感染AAV－HT1080細胞熒光表達 純化的rAAV－h(huán)BMP7各濃度組感染AAVHT1080細胞后，12h左右均有表達綠色熒光的細胞出現(xiàn)。隨著培養(yǎng)時間的延長，高濃度組細胞從培養(yǎng)板底面脫離，細胞結(jié)構(gòu)破壞，相互融合，熒光表達也融合成片，繼續(xù)培養(yǎng)則熒光表達下降；低濃度組細胞界限清晰，結(jié)構(gòu)較正常，細胞損傷輕微，熒光表達清晰持久（見圖5），6～7d達到高峰。

5 原位β－半乳糖苷酶染色法測定rAAV hBMP7感染效率和病毒滴度 rAAV－h(huán)BMP7轉(zhuǎn)染易感細胞AAV－HT1080后，病毒復(fù)制，病毒載體上的β－半乳糖苷酶基因表達，催化底物X－Gal顯色，細胞被藍染。選擇細胞形態(tài)保持較完整、數(shù)量適中（10＜n＜100）的濃度組，光學(xué)顯微鏡下計數(shù)10不同視野中的藍染細胞數(shù)，計算轉(zhuǎn)染效率：鏡下觀察發(fā)現(xiàn)10－5，10－6兩個組細胞形態(tài)完整（見圖6A），界限清晰；其他組別細胞形態(tài)損傷嚴(yán)重，細胞邊緣模糊、破裂相互融合（見圖6B），提示病毒顆粒過多，細胞發(fā)生毒性改變。計算轉(zhuǎn)染效率10－5組約為78%；10－6組約為35%。參照細胞形態(tài)變化情況可以確定，實驗獲得的rAAV－h(huán)BMP7作10－5稀釋可以獲得78%的較好轉(zhuǎn)染效率；以該組別轉(zhuǎn)染效率推算病毒感染滴度：種植細胞數(shù)／ml×感染效率×病毒實際稀釋倍數(shù)（1／稀釋用量0．1ml÷稀釋后濃度值10－5÷每孔病毒用量0．5ml），rAAV hBMP7的滴度約為2．34×1011v·g／ml，可用于后繼實驗。

圖5 rAAV－h(huán)BMP7（10－5 組）感染 AAV－HT1080細胞72h后熒光表達（A：倒置顯微鏡；B：倒置熒光顯微鏡；×100）

圖6 原位β－半乳糖苷酶染色結(jié)果（200×）

討 論

骨形成蛋白（BMPs）存在于骨、牙本質(zhì)等多種組織中，對骨組織的發(fā)育和修復(fù)重建起著關(guān)鍵性作用，BMP7是BMPs家族中促成骨能力最強的生長因子之一［4］。研究發(fā)現(xiàn)BMP7誘導(dǎo)新骨形成，一般是通過三步多分子級聯(lián)放大反應(yīng)來產(chǎn)生成骨效應(yīng)［5］。①誘導(dǎo)細胞趨化，促進特定的細胞群發(fā)生方向性趨化，進而誘導(dǎo)細胞黏附和增殖；②誘導(dǎo)和促進有絲分裂；③誘導(dǎo)細胞分化，BMP－7能夠誘導(dǎo)多種細胞向成骨型細胞分化，促進細胞基質(zhì)合成，I型、II型膠原、ALP、骨鈣素等的基因表達升高。

在口腔領(lǐng)域，許多學(xué)者嘗試將BMP7或BMP7復(fù)合其它因子用于牙周組織工程中，刺激牙周膜中的潛在細胞群分化增殖，促進牙周和頜面部組織缺損的修復(fù)與重建。Jin等［6］利用BMP－7基因修飾的皮膚成纖維細胞，附合凝膠載體支架，修復(fù)小鼠下頜牙槽骨缺損的實驗發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染組小鼠在骨缺損部位有軟骨的快速形成，繼而形成骨及牙骨質(zhì)。Yeh［7］等的研究發(fā)現(xiàn)，BMP7能促進分化的成骨細胞高表達骨鈣素及堿性磷酸酶，誘導(dǎo)形成鈣化結(jié)節(jié)，細胞成骨活性增強。證實了rhBMP－7的促成骨特性。本課題應(yīng)用前期構(gòu)建并鑒定的pAAVIRES－h(huán)rGFP－h(huán)BMP7質(zhì)粒，制備有感染性的rAAV病毒，以期獲得hBMP7在真核細胞內(nèi)的表達，為牙周組織缺損的治療做基礎(chǔ)性研究。

腺相關(guān)病毒載體具有能在人類染色體定點整合、長期穩(wěn)定表達而無致癌隱患，轉(zhuǎn)染效率高而免疫原性低等優(yōu)點，是近年來研究和應(yīng)用最廣的一種病毒類載體［8］。Kunze等［9］比較了1～5型AAV 對牙周膜細胞、牙齦細胞感染效率的差別后發(fā)現(xiàn)，各型的轉(zhuǎn)染效率存在差別，以AAV2最高，AAV4最低，其它三型介于這倆型之間。rAAV病毒的包裝，主要涉及包裝容量、包裝體系和病毒純化幾個方面。包裝容量小是rAAV載體最大的缺陷，僅為5kb左右，很多情況下不能滿足基因治療的需要，如何增加rAAV載體的包裝容量成為擴大其應(yīng)用的熱點課題［10］。本組采用的pAAVIRES－h(huán)rGFP質(zhì)粒，僅保留了AAV包裝和整合不可缺少的ITRs，不僅增加了包裝容量，在兩個ITRs之間還有一核糖體基因IRES，可以實現(xiàn)雙基因共表達，又能促使AAV的核內(nèi)定位。

rAAV傳統(tǒng)的包裝體系不僅步驟繁瑣，而且存在AV的污染難以完全去除。本組采用的AAV Helper－Free System，就是對其不斷改造的基礎(chǔ)上建立的比較完善的包裝體系［11］。其中的pAAV－RC表達AAVCap和Rep蛋白；pHelper含有與AAV包裝有關(guān)的腺病毒基因E4、E2a和VA RNA；E1a和E1b則由293包裝細胞提供；該系統(tǒng)不僅簡化了操作、提高了產(chǎn)量，而且避免了野生型AAV和AV的污染。本實驗應(yīng)用該系統(tǒng)包裝6h時，各組都出現(xiàn)熒光表達，說明該系統(tǒng)病毒“拯救”很快，而且細胞形態(tài)正常、生長狀態(tài)良好。

病毒純化的目的是去除可能的AV和野生型AAV污染，及可復(fù)制性AAV（rcAAV）雜質(zhì)（含有非目的基因DNA序列的類AAV顆粒）［12］。傳統(tǒng)的方法是硫酸銨濃縮、氯化銫密度梯度離心，操作繁瑣，病毒液損失太多［13］。近年來，吳小兵等［14］提出的氯仿處理－PEG／NaCl沉淀－氯仿反復(fù)抽提的方法，對rAAV病毒原液進行濃縮和純化，效果較為滿意。

病毒感染效率和滴度的測定，許多研究者［15］應(yīng)用AAV易感細胞（HT1080）表達熒光的細胞數(shù)（或百分比）來進行估算，簡便易行，但是計數(shù)結(jié)果容易受培養(yǎng)基底色和熒光折射的影響，估算結(jié)果有較大偏差。本組采用原位β－半乳糖苷酶染色，計數(shù)藍染細胞個數(shù)，細胞間干擾小，而且能觀察病毒顆粒對細胞形態(tài)的影響情況。

本組應(yīng)用磷酸鈣三質(zhì)粒共沉淀法，成功制備了rAAV－h(huán)BMP7，通過對照組AAV－GFP表達熒光的細胞數(shù)量，測定包裝效率為94．16±0．13%。原位β－半乳糖苷酶染色估算rAAVhBMP7病毒原液的感染滴度為2．34×1011v．g／ml?？捎糜诤罄^實驗的細胞轉(zhuǎn)染。

［1］ Wozney JM．Overview of bone morphogenetic proteins［J］．Spine（Phila Pa 1976），2002，27（16Suppl 1）：2－8．

［2］ St George JA．Gene therapy progress and prospects adenoviral vectors［R］．GeneTher，2003，10（14）：1135－1137．

［3］ 石建峰，李 昂，饒國洲，等．hBMP－7基因重組腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及人牙髓細胞轉(zhuǎn)染的研究［J］．陜西醫(yī)學(xué)雜志，2008，37（1）：73－75．

［4］ Schlance T，Andree B，Arfnold H H，et al．BMP－2is required for early hears development during a distinct time period［J］．Mech Dev，2000，91（1－2）：259－270．

［5］ Yamazoe T，Aoki K，Simokawa H，et al．Gene expression of bone matrix proteins in a calcified tissue appeared in subcutaneously transplanted rat dental pulp［J］．J Med Dent Sci，2002，49（1）：57－66．

［6］ Jin QM，Anusaksathion O，Webb SA，et al．Gene therapy of bone morphogenetic protein for periodontal tissue engineering［J］．J Periodontol，2003，74（2）：202－213．

［7］ Yeh LC，Lee JC．Co－transfection with the osteogenic protein（OP）－1gene and the insulin－like growth factor（IGF）－1gene enhanced osteoblastic cell differentiation［J］．Biochim Biophys Acta，2006，1763（1）：57－63．

［8］ McCarty D M．Self－complementary AAV vectors；Advances and applications［J］．Mole Ther，2008，16（10）：1648－1656．

［9］ Kunze M，Huber A，Krajewski A，et al．Efficient gene transfer to periodontal ligament cells and human gingival fibroblasts by adenoassociated virus vectors［J］．J Dent，2009，37（7）：502－508．

［10］ Bainbridge J W，Smith A J，Barker S S，et al．Effect of gene therapy on visual function in Leber’s congenital amaurosis［J］．N Engl J Med，2008，358（3）：2231－2239．

［11］ Xiao X，Li J，Samulski RJ．Production of high－titer recombinant adeno－associated virus vectors in the absence of helper adenovirus［J］．J Virol，1998，72（4）：2224－2232．

［12］ 刁 勇，王啟釗，肖衛(wèi)東，等．重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)性雜質(zhì)［J］．生物工程學(xué)報，2011，27（5）：717－723．

［13］ Dracopoli N．Current protocols in human genetics［M］．New York：John Wiley，1996：257－336．

［14］ 吳小兵，董小巖，伍志堅，等．一種快速高效分離和純化重組腺病毒伴隨病毒載體的方法［J］．科學(xué)通報，2000，45（19）：2071－2075．

［15］ 時志斌，強 輝，樊立宏，等．重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白7基因腺相關(guān)病毒載體的構(gòu)建及其體外生物學(xué)活性［J］．西安交通大學(xué)學(xué)報，2011，31（5）：573－577．