摘要：采用人工土壤試驗(yàn)法，研究了在不同Pb暴露環(huán)境中赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）SOD活性的變化。結(jié)果表明，染毒5 d時(shí)，當(dāng)受到低濃度Pb脅迫時(shí)，蚯蚓體內(nèi)SOD活性降低；當(dāng)受到高濃度Pb脅迫時(shí)，蚯蚓體內(nèi)SOD活性不同程度升高。染毒15 d時(shí)隨Pb濃度增大，蚯蚓體內(nèi)SOD活性表現(xiàn)出升高趨勢。蚯蚓體內(nèi)SOD活性的變化規(guī)律性不明顯。

關(guān)鍵詞：蚯蚓；超氧化物歧化酶；鉛；酶活性

中圖分類號(hào)：X503.22 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）04-0781-03

Responses of SOD Activity of Earthworm to Soil Plumbum Pollution

HE Ying-sen，XU Xiao-yan，GAO Xiao-ling，LAI Lin，CHEN Cheng

（Department of Biology，Sichuan College of Education，Chengdu 610041，China）

Absteract： The responses of the superoxide dismutase（SOD） activities of earthworm（Eisenia fetida） to soil plumbum （Pb） pollution were studied using the artificial soil test method. The results indicated that the SOD activities of earthworm polluted for 5 d by Pb decreased under the condition of low Pb stress， while increased in different levels under the high Pb stress condition. When polluted for 15 d by Pb， the SOD activity increased with the increasing of expose time. The regularity of the SOD activity change in earthworm was not obvious.

Key words： earthworm（Eisenia fetida）； superoxide dismutase（SOD）； plumbum； enzyme activity

蚯蚓不僅是陸地上生物量最大的一類土壤動(dòng)物，而且在土壤的物理、化學(xué)和生物過程中扮演重要的角色[1]。它們是生態(tài)系統(tǒng)中的關(guān)鍵種并被廣泛用作環(huán)境污染的生物指示者，被認(rèn)為是進(jìn)行化學(xué)物質(zhì)生態(tài)毒理學(xué)試驗(yàn)的合適陸生生物[2-4]。近年來，蚯蚓在重金屬污染土壤中的應(yīng)用開始受到重視，研究表明，蚯蚓對土壤重金屬有一定的耐性，并可以通過取食、作穴、代謝等生命活動(dòng)過程，提高土壤中重金屬的生物有效性[5]，因此可以將蚯蚓用于土壤重金屬污染的生物修復(fù)。由于蚯蚓是土壤生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，利用蚯蚓來指示土壤污染狀況，已成為對土壤污染生態(tài)毒理診斷的一項(xiàng)重要指標(biāo)[6，7]。目前，國內(nèi)外學(xué)者就環(huán)境污染物對蚯蚓的影響，特別是重金屬污染對蚯蚓的影響進(jìn)行了較多的研究[8-11]。

鉛不僅是一種重要的重金屬環(huán)境元素[12]，而且是一種積累性劇毒元素[13]。Pb在土壤中吸附性強(qiáng)，被表層土壤滯留后殘留時(shí)間長，屬難遷移累積型重金屬[14]。同時(shí)，鉛也是常見的具有潛在毒性的重金屬元素，是環(huán)境中主要的重金屬污染物[15]。

蚯蚓在外源重金屬污染過的土壤中通過食物鏈富集并對土壤重金屬有一定的耐性，所富集重金屬可以引起蚯蚓體內(nèi)酶活性發(fā)生變化，研究者提出可將蚯蚓體內(nèi)酶活性變化作為生物標(biāo)志物來指示土壤污染狀況[16-18]。在生物體內(nèi)，活性氧的消除主要是由抗氧化防御酶系統(tǒng)來完成，其中，超氧化物歧化酶（SOD）是消除細(xì)胞內(nèi)生物氧化產(chǎn)生超氧陰離子自由基的金屬酶類，是生物體內(nèi)重要的氧自由基消除劑[19]。生物體有適應(yīng)環(huán)境改變的能力，如果外界因素誘導(dǎo)引起生物體內(nèi)氧自由基的產(chǎn)生量增加，則會(huì)誘發(fā)SOD酶活性的變化[20，21]。研究表明，在不同重金屬污染的土壤中，蚯蚓體內(nèi)SOD活性響應(yīng)不同[22，23]。在重金屬Pb污染對蚯蚓影響的研究方面，比較多的研究集中在Pb對蚯蚓的毒害作用上[24，25]。而不同濃度外源性的Pb對蚯蚓體內(nèi)超氧化物歧化酶（SOD）活性影響的研究還不充分。因此，在不同外源Pb污染脅迫中，研究了Pb暴露時(shí)間不同引起的蚯蚓體內(nèi)SOD活性變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試土壤 供試土壤取自成都市西郊大邑縣農(nóng)場大田，該地處于成都平原到川西高原過渡地帶，位于北緯30°25′-30°49′，東經(jīng)102°54′-103°54′。采樣深度0～20 cm，經(jīng)采集多點(diǎn)土壤后， 剔除殘根等雜物， 混勻后隨機(jī)取樣， 過2 mm篩， 放冰盒中帶回實(shí)驗(yàn)室， 在4 ℃冰箱內(nèi)臨時(shí)保存?zhèn)溆?。土壤樣品的理化性質(zhì)見表1。

1.1.2 供試蚯蚓 赤子愛勝蚓（Eisenia foetida）購于四川蚯蚓養(yǎng)殖有限公司。試驗(yàn)選取體重0.4～0.5 g/條，大小相同、形態(tài)相似、發(fā)育良好的蚯蚓，試驗(yàn)前馴養(yǎng)1周。

1.1.3 主要藥品 磷酸二氫鉀，鄰苯三酚，三羥甲基氨基甲烷，氫氧化鈉等，均為分析純。

1.1.4 主要儀器 微電腦人工氣候箱（SPX-300IC，上海博迅儀器公司）；高速冷凍離心機(jī)（GL-20G-Ⅱ，上海）；722光柵分光光度計(jì)（上海第三分析儀器廠）；）PHS-10A型數(shù)字式pH/離子計(jì)（PHS-10A，上海）等。

1.2 方法

1.2.1 染毒處理預(yù)試驗(yàn) 蚯蚓急性毒性試驗(yàn)按照人工土壤法[26]， 選用2個(gè)塑料盆，隨機(jī)選擇大小一致、健康活潑的蚯蚓25條，置于溫度20～25 ℃、濕度80%的黑暗處染毒。試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)平行組，以去離子水為空白對照組。采用鉛濃度為1 000 mg/（kg土）對蚯蚓進(jìn)行染毒處理（其中一個(gè)為平行試驗(yàn)），將其處于相同環(huán)境下觀察1周后發(fā)現(xiàn)，2個(gè)塑料盆中蚯蚓生活正常，沒有死亡。

1.2.2 染毒處理試驗(yàn) 將預(yù)先培養(yǎng)好的蚯蚓洗凈，在黑暗處放置24 h，放入鋪有濕潤濾紙的玻璃缸中，其上再覆蓋一層濕潤的濾紙，并用保鮮膜封口，清腸后，每個(gè)塑料燒杯中隨機(jī)放入20條蚯蚓，杯口用紗布蓋好，防止水分的蒸發(fā)和蚯蚓的逃逸。將塑料燒杯放入溫度為（20±2） ℃，濕度為70%的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，試驗(yàn)周期為15 d。試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)Pb濃度梯度，分別為0、200、400、600、800、1 000 mg/（kg土）。

1.2.3 SOD粗酶液的制備和活性的測定 SOD粗酶液的制備：蚯蚓經(jīng)染毒5、10、15 d，分別從每個(gè)處理組中取出8條蚯蚓，清腸1 d，將蚯蚓沖洗干凈，用吸水紙吸干水分，用去離子水洗凈，加入約3倍體積的0.05 mol/L、pH 7.8的磷酸緩沖液勻漿 （8 000 r/min勻漿3 min），然后在0～4 ℃條件下離心（3 000 r/min離心15 min），上清液即為超氧化物歧化酶的粗酶液，置于1～4 ℃環(huán)境中保存?zhèn)溆?。SOD 活性測定采用文獻(xiàn)[27]的方法。酶活性定義為在一定條件下使每毫升反應(yīng)液每分鐘自氧化速率抑制50% 的酶量為一個(gè)酶活性單位。

2 結(jié)果與分析

在外源重金屬Pb的脅迫下，分別在蚯蚓染毒5、10、15 d時(shí)取出蚯蚓測定SOD活性分別見圖1、圖2、圖3。在外源重金屬Pb的脅迫下，濃度為200、400、600、800、1 000 mg/（kg土）的5個(gè)試驗(yàn)組，在染毒初期（5 d后），在Pb濃度200、400、600 mg/（kg土）的輕度脅迫時(shí)SOD活性有所降低；在Pb濃度800～1 000 mg/（kg土）重度脅迫時(shí)，蚯蚓體內(nèi)SOD活性有所提高（圖1）。隨染毒時(shí)間的延長，在10 d時(shí)，蚯蚓體內(nèi)SOD活性在Pb濃度600～1 000 mg/（kg土）脅迫時(shí)提高比較明顯（圖2）。在15 d時(shí)，蚯蚓體內(nèi)的SOD活性隨著外源重金屬Pb濃度的增加總體上表現(xiàn)出升高的趨勢。說明外源重金屬Pb對蚯蚓SOD活性早期有抑制作用，晚期有誘導(dǎo)作用，并且在Pb濃度較大的脅迫時(shí)，隨著脅迫時(shí)間的延長，對蚯蚓SOD活性的誘導(dǎo)作用比較明顯。

3 討論

蚯蚓是生態(tài)系統(tǒng)土壤物質(zhì)小循環(huán)中的重要一環(huán)，影響著農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)，在食物鏈中起著污染物傳遞的橋梁作用[28，29]。在重金屬污染土壤中，蚯蚓體內(nèi)存在多種受污染物抑制或?qū)ξ廴疚锏恼T導(dǎo)有響應(yīng)的酶系，這些酶系包括調(diào)控基礎(chǔ)代謝與生理活動(dòng)的功能酶系、對外源物質(zhì)具有降解作用的解毒或水解酶系以及其他具有防御功能的酶系如抗氧化酶、溶菌酶等[30]。因此，可以根據(jù)蚯蚓體內(nèi)酶系的檢測指標(biāo)隨土壤中重金屬污染程度的變化來反映土壤中重金屬污染程度[31]。目前，應(yīng)用蚯蚓體內(nèi)的一些敏感生理生化指標(biāo)作為污染物暴露的標(biāo)記物已成為研究的熱點(diǎn)，如細(xì)胞色素P450酶系、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶、抗氧化酶系（SOD、POD和CAT）和一些金屬硫蛋白等[32，33]。這些指標(biāo)可從微觀分子水平反映環(huán)境介質(zhì)的健康狀況，因此有可能成為新的環(huán)境污染早期預(yù)警的重要手段。

通過Pb對赤子愛勝蚓SOD活性影響試驗(yàn)，研究了Pb脅迫下赤子愛勝蚓SOD活性對不同染毒時(shí)間的響應(yīng)，可為將赤子愛勝蚓體內(nèi)的抗氧化酶活性變化作為重金屬環(huán)境污染的早期診斷和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測的指標(biāo)提供一定的依據(jù)。在對蚯蚓體內(nèi)受重金屬污染誘導(dǎo)有響應(yīng)的酶系活性變化的研究上，不僅要關(guān)注蚯蚓對污染物的敏感性，還要考慮到蚯蚓對污染物的耐性。由于蚯蚓生命活動(dòng)對土壤中的重金屬化學(xué)行為產(chǎn)生直接或間接的影響[34]，這些影響包括土壤pH變化和重金屬在土壤中不同形態(tài)變化等[35，36]。如何把蚯蚓活動(dòng)對土壤重金屬不同形態(tài)的影響和對重金屬富集能力以及蚯蚓體內(nèi)對重金屬誘導(dǎo)有響應(yīng)的酶系敏感性和靈敏度結(jié)合起來進(jìn)行研究，尤其是在復(fù)合污染水平上對蚯蚓體內(nèi)酶系活性影響的研究上是今后研究的重點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 黃初龍，張雪萍.蚯蚓環(huán)境生態(tài)作用研究進(jìn)展[J].生態(tài)學(xué)雜志，2005，24（12）：1466-1470.

[2] CORTET J， GOMOT D E， VAUFLER A， et al. The use of invertebrate soil fauna in monitoring pollutant effects[J]. Euro J Soil Bio，1999，35（3）：115-134.

[3] 王振中，張直梅，胡覺蓮，等.土壤重金屬污染對蚯蚓影響的研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，1994，14（2）：236-243.

[4] 趙 麗，邱江平，沈嘉林，等.重金屬鎘、銅對蚯蚓的急性毒性試驗(yàn)[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2005，23（4）：366-370.

[5] MA Y， DICKINSON N M， WONG M H. Toxicity of Pb/Zn mine tailings to the earthworm Pheretima and the effects of burrowing on metal availability[J]. Biol Tertil Soils，2002， 36：79-86.

[6] LOWE C N，BUTT K R. Earthworm culture， maintenance and species selection in chronic ecotoxicological review[J]. European Journal of Soil Biology，2007，41：281-288.

[7] SPUGEON D J， HOPKIN S P.The effects of metal contamination on earthworm populations around a smelting work：quantifying species effects[J].Elsevier Science，1996，4（2）：147-160.

[8] 俞協(xié)治，成杰民.蚯蚓對土壤中銅、鎘生物有效性的影響[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2003，23（5）：922-928.

[9] CARPENE E，ANDREANI G，MONARI M，et a1.Distribution of Cd，Zn，Cu and Fe among selected tissues of the earthworm（Allolobophora caliginosa） and eurasian woodcock（Scolopax rusticola）[J].Science of the Total Environment，2006，363（1-3）：126-135.

[10] 伏小勇，秦 賞，楊 柳，等.蚯蚓對土壤中重金屬的富集作用研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2009，28（1）：78-83.

[11] 李志強(qiáng)，王彬彬，聶俊華.銅污染對蚯蚓體重的影響與其銅富集特征[J].生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，29（3）：1408-1414.

[12] 王 艷，王金達(dá).土壤鉛的濃度與油菜生長相互影響的研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2004，23（1）：47-50.

[13] 黎佳佳，付慶靈.辣椒對灰潮土重金屬Cd、 Pb污染的反應(yīng)與礦質(zhì)元素吸收[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2005，24（2）：236-241.

[14] 粟 銀，袁興中，曾光明，等.土壤-植物系統(tǒng)中鉛的遷移轉(zhuǎn)化影響因素研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（16）：6953-6955.

[15] HSU M J，SELVARAJ K，AGORAMOORTHY G. Taiwan’s industrial heavy metal pollution threatens terrestrial biota[J].Environmental Pollution，2006，143（2）：327-334.

[16] 王 慧，張玉龍，黨秀麗，等. 土壤鎘、鋅污染對蚯蚓纖維素酶活性的影響[J].生態(tài)環(huán)境，2008，17（2）：661-665.

[17] 卜元卿，駱永明，滕 應(yīng)，等.銅暴露對赤子愛勝蚓（Eisenia fetida）抗氧化酶活力的影響[J].環(huán)境化學(xué)，2007，26（5）：593-597.

[18] MORGAN A J，EVANS M，WINTERS C，et a1.Assaying the effects of chemical ameliorants with earthworms and plants exposed to a heavily polluted metalliferous soil[J].European Journal Soil Biology，2002，38：323-327.

[19] 趙學(xué)蘭，王景安.蚯蚓超氧化物歧化酶理化性質(zhì)的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006（18）：207-209.

[20] 薛銀剛，王曉蓉，顧雪元，等.四溴雙酚A對赤子愛勝蚓的急性毒性及抗氧化防御系統(tǒng)酶的影響[J].生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2009， 4（1）：93-100.

[21] 賈秀英，陳志偉.鎘對鯽魚酶活性毒性的研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2002，14（3）：155-158.

[22] 林少琴，蘭瑞芳.金屬離子對蚯蚓CAT、GSH-Px及SOD酶活性的影響[J].海峽藥學(xué)，2001，13（2）：23-25.

[23] 梁海燕，李銀生，孫 靜，等.鋁離子污染脅迫對蚯蚓重要抗氧化酶活性的影響[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2007， 25（6）：551-556.

[24] 劉德鴻，劉德輝，成杰民.土壤Cu、Cd污染對兩種蚯蚓種的急性毒性[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2005，11（6）：706-710.

[25] 宋玉芳，周啟星，許華夏，等.土壤重金屬污染對蚯蚓的急性毒性效應(yīng)研究[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2002，13（2）：187-190.

[26] 邱江平.蚯蚓與環(huán)境保護(hù)[J].貴州科學(xué)，2008，18（1-2）：116-133.

[27] 謝衛(wèi)華， 姚菊芳，袁勤生. 聯(lián)苯三酚自氧化法測定超氧化物歧化酶活性的改進(jìn)[J].醫(yī)藥工業(yè)，1988，19（5）：217-219.

[28] LAVELLE P. Earthworm activity and the soil system[J]. Bio Fert Soils，1988，6：237-251.

[29] SPURGEON D J，STURZENBAUM S R，SVENDSEN C，et a1.Toxicological，cellular and gene expression in earthworm exposed to copper and cadmium[J].Comparative Biochemistry and Physiology，Part C，2004，138：11-21.

[30] 顏增光，何巧力，李發(fā)生.蚯蚓生態(tài)毒理試驗(yàn)在土壤污染風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)中的應(yīng)用[J].環(huán)境科學(xué)研究，2007，20（1）：134-142.

[31] 王 新，周啟星.土壤重金屬污染生態(tài)過程、效應(yīng)及修復(fù)[J].生態(tài)科學(xué)，2004，23（3）：278-281.

[32] 高 巖， 駱永明.蚯蚓對土壤污染的指示作用及其強(qiáng)化修復(fù)的潛力[J].土壤學(xué)報(bào)，2005，42（1）：140-145.

[33] 張 薇，宋玉芳，孫鐵珩，等.土壤低劑量芘污染對蚯蚓若干生化指標(biāo)的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2007，18（9）：2091-2103.

[34] WILLEMS J G M，MAIRINISSEN J C Y，BLAIR J. Effects of earthworm on nitrogen mineralization[J]. Biol Fertile Soil，1996，23：57-63.

[35] 袁宇飛，李光德，林 立，等.在蚯蚓影響下土壤Pb、Cd有效態(tài)的變化及小白菜對Pb、Cd的富集轉(zhuǎn)移作用[J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2010，19（2）：79-85.