摘要：試驗(yàn)從海金沙的根、莖、葉器官中分離獲得了內(nèi)生真菌17株，鑒定出16株，另外1株因不產(chǎn)孢子而未被鑒定出，分別屬于3個(gè)綱4個(gè)目5個(gè)科8個(gè)屬。在鑒定的8屬內(nèi)生真菌中，以青霉屬為優(yōu)勢屬，占總株數(shù)的23.5%，其次是頂枝孢屬和鏈格孢屬，各占總株數(shù)的17.6%。表明海金沙不同部位、不同季節(jié)內(nèi)生真菌的數(shù)量、分布、種群及其組成存在差異，體現(xiàn)了內(nèi)生真菌生態(tài)分布的多樣性。

關(guān)鍵詞：海金沙；內(nèi)生真菌；多樣性

中圖分類號：Q949.36+7.2；Q948.12+2.3；Q346+.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）04-0865-03

Study on the Diversity of Endophytic Fungi of Lygodium japonicum

GAN Jin-lian，PENG Qin，ZHAN Shou-fa，F(xiàn)AN You-fu，CHEN Ye

（College of Life Science， Jiujiang University， Jiujiang 332000，Jiangxi，China）

Abstract： 17 strains of endophytic fungi were firstly isolated from root， stem and leaf tissues of Lygodium japonicum （Thunb.） Sw.， of which 16 strains were identified belonging to 8 genera， 5 families， 4 orders， 3 classes； and one strain had not been identified owing to lack of spores. Among the 8 genera of identified endophytic fungi， Penicillium Link ex Fr. was the dominant genera， accounting for 23.5% of the total number； the second were Acremonium Link and Alternaria Nees ex Fr.， each of which was comprised 17.6% of the total number. Quantity， distribution， and population constitution of endophytic fungi in L. japonicum varied in different tissues of the plants collected in different seasons， which reflected the ecological diversity of endophytic fungi in L. japonicum.

Key words： Lygodium japonicum （Thunb.） Sw.； endophytic fungi； diversity

植物內(nèi)生真菌（Endophytic fungi）是指那些經(jīng)過長期協(xié)同進(jìn)化，其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物組織內(nèi)，而且不會(huì)引起宿主產(chǎn)生可見病癥的真菌。植物內(nèi)生真菌與宿主植物在長期的生態(tài)系統(tǒng)演化過程中形成了互惠共生關(guān)系，內(nèi)生真菌能產(chǎn)生與宿主相同或相似的生物活性物質(zhì)，既具有促進(jìn)植物生長、增強(qiáng)抗病能力、提高抗逆性等作用，又具有醫(yī)學(xué)上抗腫瘤、抗微生物等對人類有利的生物功效，因而在人們的生產(chǎn)與生活中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

海金沙[Lygodium japonicum（Thunb.）Sw.]系海金沙科（Lygodiaceae）海金沙屬（Lygodium Sw.）多年生蕨類植物，主產(chǎn)于廣東、江蘇、浙江、湖南、湖北、四川、陜西、甘肅等省[1]。海金沙多生于陰濕山坡灌叢中或路邊林緣旁，以全草或者干燥成熟的孢子入藥，味甘淡，性寒，有清熱解毒、通淋止痛、利膽消腫的功效，為治療泌尿系統(tǒng)感染、尿路結(jié)石、腎炎水腫、感冒發(fā)熱、腸炎，痢疾、癌癥等疾病的常用中草藥[2-5]。海金沙的化學(xué)成分主要有海金沙素、反式-對-香豆酸、咖啡酸、棕櫚酸、油酸、亞油酸、十六碳烯酸，亦含脂肪油、氨基酸、黃酮、多糖等物質(zhì)[6-13]，因此海金沙植物資源的開發(fā)利用備受關(guān)注。但目前有關(guān)海金沙內(nèi)生真菌的研究鮮見，而且由于對海金沙自然資源的不合理開發(fā)所造成的資源匱乏和環(huán)境破壞已成為亟待解決的問題。試驗(yàn)通過對海金沙內(nèi)生真菌多樣性的研究，旨在尋找替代海金沙的新藥源，為采用微生物發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)具有抗腫瘤活性的有效成分物質(zhì)提供理論依據(jù)，以減少對自然資源的直接利用，并為藥用蕨類植物資源的野生保護(hù)和合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

分離內(nèi)生真菌所用的植物材料為鳳尾蕨海金沙植株的根、莖和葉，采自江西省九江市南湖公園。分離培養(yǎng)基為WA-抗生素培養(yǎng)基：瓊脂20 g、氨芐青霉素200 mg、鏈霉素200 mg、去離子水1 000 mL；純化培養(yǎng)基為改良的馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、10% 海金沙葉水浸提液100 mL加去離子水定容至

1 000 mL，自然pH（使用前在培養(yǎng)基中加80 U/mL慶大霉素1 mL）；促孢培養(yǎng)基：KH2PO4 1.0 g、KNO3 1.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、KCl 0.5 g、淀粉0.2 g、葡萄糖0.2 g、蔗糖0.2 g、瓊脂20.0 g、去離子水1 000 mL，自然pH。

1.2 海金沙內(nèi)生真菌的分離鑒定

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng) 取新鮮的海金沙根、莖和葉，用自來水反復(fù)沖洗干凈，在超凈工作臺(tái)上切成1 cm長的小段，然后進(jìn)行表面消毒，具體操作流程是：無菌水→0.01%升汞（5 s）→無菌水→無菌水→70%乙醇（5 s）→無菌水→無菌水→無菌水，然后用無菌解剖刀剝?nèi)「髌鞴俚捻g皮部，切成0.5 cm×0.5 cm大小的小片段。用無菌鑷子將已經(jīng)消毒的植物體放在PDA平板上（平板在使用前要加慶大霉素，用量同前，并均勻推平），然后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～5 d后即可看見從植物體周圍長出的菌絲。為了檢查表面消毒是否徹底，另外做對照處理；將上述同樣條件下處理過的材料不作切割直接種植于PDA平板上，置于相同的條件下培養(yǎng)，以樣品周圍是否有菌絲生長來判斷分離菌是否能確定為內(nèi)生真菌。

1.2.2 內(nèi)生真菌的分離與純化 觀察從植物體上長出的菌落，挑取不同的菌落在新的平板上培養(yǎng)，反復(fù)多次直至得到純種菌落，然后轉(zhuǎn)入PDA斜面培養(yǎng)基上（試管），再在28 ℃條件下純化培養(yǎng)，4 ℃冰箱里保藏備用。

1.2.3 內(nèi)生真菌的鑒定 觀察純化好的單菌落真菌，記錄其編號及來源并拍照。從純化培養(yǎng)數(shù)日的菌落上挑取菌絲并連同分生孢子制成裝片，置于光學(xué)顯微鏡下觀察真菌特征（菌絲、有性或無性孢子、孢子的著生狀態(tài)等形態(tài)特征）。查閱有關(guān)真菌分類文獻(xiàn)資料[14-16]，確認(rèn)所分離獲得的內(nèi)生真菌的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 海金沙內(nèi)生真菌種群多樣性

從海金沙的根、莖、葉組織中共分離獲得內(nèi)生真菌17株，鑒定出16株，另外1株因不產(chǎn)孢而未被鑒定出，分別屬于3個(gè)綱4個(gè)目5個(gè)科8個(gè)屬。在鑒定的8屬內(nèi)生真菌中，以青霉屬（Penicillium Link，F(xiàn)r.）為優(yōu)勢屬，占總株數(shù)的23.5%，其次是頂枝孢屬（Acremonium Link）和鏈格孢屬（Alternaria Nees ex Fr.），各占總株數(shù)的17.6%。這些真菌多數(shù)屬于半知菌綱，少數(shù)屬于子囊菌綱和核菌綱，表明海金沙內(nèi)生真菌的分布存在生態(tài)分布的種群多樣性，具體見表1。

2.2 不同季節(jié)對海金沙內(nèi)生真菌分布的影響

由于季節(jié)更替，造成外在環(huán)境因素與海金沙體內(nèi)微生態(tài)環(huán)境發(fā)生變化，使得植物的內(nèi)生真菌生長條件也隨之發(fā)生改變，因而導(dǎo)致培養(yǎng)出來的菌株出現(xiàn)一定的差異。具體情況見表2。從表2可以看出，春夏季節(jié)培養(yǎng)出來的菌株數(shù)量要比秋冬季節(jié)的多。由于九江地區(qū)夏季比較潮濕，而海金沙正是在潮濕的環(huán)境下生長發(fā)育比較好，并且這種潮濕環(huán)境比較適合內(nèi)生真菌的生長，其中主要是以青霉屬、枝孢霉屬為優(yōu)勢屬；而秋冬季的濕度與溫度都比春夏季低，對內(nèi)生真菌的生長有所抑制，所以相比較春夏季節(jié)真菌的數(shù)量較少，但其中的優(yōu)勢屬仍是青霉屬，另一個(gè)優(yōu)勢屬是頂枝孢屬。這個(gè)結(jié)果說明海金沙內(nèi)生真菌的分布存在季節(jié)差異，其內(nèi)生真菌的生態(tài)分布與季節(jié)有關(guān)。

2.3 不同植物器官對海金沙內(nèi)生真菌分布的影響

海金沙的根、莖、葉等不同器官上發(fā)生的內(nèi)生真菌在種群分布和優(yōu)勢種群以及各種屬出現(xiàn)頻率的差異比較結(jié)果見表3。從表3可見，海金沙不同器官分離出的內(nèi)生真菌頻率高低順序?yàn)榍o、根、葉，表明植株各器官韌皮部所占比例大的部位內(nèi)生真菌數(shù)量較多，而木質(zhì)部所占比例大的部位次之，從葉脈里分離獲得的內(nèi)生真菌數(shù)量最少，說明內(nèi)生真菌在海金沙不同器官上的分布是不同的。

3 討論

海金沙根、莖、葉等不同器官上的內(nèi)生真菌在數(shù)量、種群分布和優(yōu)勢種群方面都存在較大的差異，說明海金沙內(nèi)生真菌存在數(shù)量和種群多樣性的特點(diǎn)。同種植物不同部位內(nèi)生真菌種類產(chǎn)生差異的原因可能是由于不同部位的微環(huán)境如通氣狀況、酶構(gòu)成和其他化學(xué)成分存在差異造成的，因而適合不同內(nèi)生真菌類群的侵入和定殖。

從植物中尋找抗菌、抗腫瘤的天然活性物質(zhì)是長期以來新型藥物研究的重要內(nèi)容和可行途徑，現(xiàn)在人類已成功地從紅豆杉屬（Taxus L.）植物中分離出了內(nèi)生真菌，并將之開發(fā)為生產(chǎn)抗癌新藥的生物來源[17]；目前已報(bào)道的植物內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物涉及到抗菌、殺蟲、促進(jìn)植物生長等多個(gè)方面[18]。在海金沙植物內(nèi)生真菌中，某些屬種真菌具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，如自然界的廣布類群青霉屬等。而關(guān)于海金沙其他內(nèi)生真菌的潛在應(yīng)用價(jià)值，還有待進(jìn)一步研究。

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