摘要：為獲取工業(yè)生產(chǎn)上有潛在應(yīng)用價(jià)值的低溫淀粉酶產(chǎn)生菌，從高黎貢山百花嶺南齋公房采集的土樣中定向篩選得到10株產(chǎn)淀粉酶菌株，選擇其中透明圈有效值最大的GD-6菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵。結(jié)果表明，該菌株最適產(chǎn)酶溫度為20 ℃， 最佳產(chǎn)酶pH 為7.0，160 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h后，產(chǎn)酶活性為420.9 IU/（mL·min）。

關(guān)鍵詞：高黎貢山；低溫淀粉酶產(chǎn)生菌；篩選；酶活性

中圖分類號(hào)：S154.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）04-0784-03

Screening of Cold-Active Amylase-Producing Strain from Soil in Gongshan of Gaoli

YU Li，YAN Ai-fen

（Department of Resources and Environment， Baoshan University， Baoshan 678000， Yunnan，China）

Abstract： In order to obtain cold-active amylase-producing strain with potential value for industrial production， 10 amylase-producing strains were isolated from Southern Zhaigongfang of Gongshan in GaoLi. The strain， GD-6， which had effective value for maximum of transparent circle， was chose to ferment. The results showed that the optimal enzyme-producing condition of this strain was as follows： 20 ℃， pH 7.0， 160 r/min shake flask for 24 h. Under this optimal condition， the amylase activity was 420.9 IU/（mL·min）.

Key words： Gongshan of Gaoli； cold-active amylase-producing strain； screening； enzyme activity

淀粉酶是能催化淀粉水解轉(zhuǎn)化成葡萄糖、麥芽糖及其他低聚糖的一群酶的總稱[1]。低溫淀粉酶是一個(gè)相對(duì)的概念，其最適作用溫度比嗜溫淀粉酶要低20～30 ℃，而且在0 ℃有一定的酶活性。由于低溫淀粉酶具有在低溫下有效發(fā)揮催化作用的特點(diǎn)，使其在生物工程領(lǐng)域及解決現(xiàn)代能源危機(jī)中有著廣泛的應(yīng)用前景[2]。有研究者從黃海、東海海底淤泥樣品中分離出低溫淀粉酶菌株P(guān)enicillum sp. FS010441，并對(duì)其進(jìn)行了研究[3]。作者通過對(duì)高黎貢山高海拔地區(qū)土樣進(jìn)行定向分離篩選研究，得到10株具有產(chǎn)淀粉酶能力菌株，對(duì)其中一株產(chǎn)酶能力較好的菌株進(jìn)行了產(chǎn)酶條件的初步研究，以期篩選出工業(yè)生產(chǎn)上有潛在應(yīng)用價(jià)值的低溫淀粉酶菌株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 土壤樣品采自高黎貢山百花嶺南齋公房（海拔3 150 m）。

1.1.2 培養(yǎng)基 富集培養(yǎng)基?？扇苄缘矸? g/L，蛋白胨1 g/L，牛肉膏0.5 g/L，NH4NO3 1 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g/L，KCl 0.5 g/L，自然pH。固體平板分離培養(yǎng)基。可溶性淀粉2 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，K2HPO4 3 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O微量，MgSO4·7H2O 微量，瓊脂15 g/L，pH 7.0。該培養(yǎng)基不加瓊脂作為發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝于250 mL三角瓶?jī)?nèi)，每瓶100 mL。

1.1.3 試劑 DNS試劑（二硝基水楊酸試劑）。用比色定糖法測(cè)定酶解液中還原糖的含量以測(cè)定酶活性。稱取酒石酸鈉22.75 g溶于125 mL水中，于溶液中依次加入3，5-二硝基水楊酸0.875 g，氫氧化鈉 5 g，加熱溶解，再加入重蒸酚0.625 g，無水亞硫酸鈉0.625 g，攪拌使之溶解，冷卻后定容至250 mL，放于棕色瓶中，放置7 d后使用[4]。500 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液。稱取105 ℃干燥2 h的分析純葡萄糖0.125 g，加水溶解，稀釋定容至250 mL。檸檬酸緩沖液。以0.1 mol/L的檸檬酸溶液和0.1 mol/L的檸檬酸三鈉溶液按比例混合，配制不同pH的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液，用于1%淀粉溶液配制和酶活性測(cè)定。盧哥（Lugol）氏碘液。盧哥（Lugol）氏碘液按文獻(xiàn)[5]的方法配制。1%的淀粉溶液。1 g可溶性淀粉加入2.5 mL水溶解，再加35 mL沸水煮沸2 min，使其冷卻加入25%的檸檬酸鈉緩沖溶液至100 mL，作為酶活性測(cè)定的底物[6]。

1.2 方法

1.2.1 淀粉酶產(chǎn)生菌的分離篩選方法 稱取土壤樣品10 g置于裝有90 mL無菌水的三角瓶中，劇烈振蕩10 min使樣品顆粒分散均勻。靜置5 min，取懸液10 mL置于裝有100 mL富集培養(yǎng)基的三角瓶中（3瓶重復(fù)）。37℃搖瓶培養(yǎng)3 d后，取培養(yǎng)液0.1 mL涂布培養(yǎng)于固體平板分離培養(yǎng)基中，37 ℃ 恒溫箱培養(yǎng)。菌體生長(zhǎng)后，用盧哥氏碘液判斷是否有淀粉分解，通過測(cè)量透明圈大小，初步判斷水解淀粉的能力，挑取透明圈直徑（D）與菌落直徑（d）比值較大的菌落進(jìn)一步分離純化，將純化后的單菌落保存于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基中。

1.2.2 菌株發(fā)酵條件確定和粗酶液的提取 將純化后的菌株活化后制成菌懸液，以2%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，分別考查菌株在溫度5、10、15、20、25、30、35、40 ℃和pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0條件下的產(chǎn)酶情況，160 r/min搖床培養(yǎng)24 h，以確定適宜的產(chǎn)酶發(fā)酵溫度和pH。發(fā)酵結(jié)束后直接用發(fā)酵液作為粗酶液用于酶活性測(cè)定。

1.2.3 DNS 法制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作參考文獻(xiàn)[7]的方法，以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.4 低溫淀粉酶活性的測(cè)定方法 取0.5 mL發(fā)酵液加入1 mL 1%的淀粉溶液使兩者充分混合后37 ℃水浴5 min，再把該混合液煮沸5 min，終止反應(yīng)，再加入1 mL DNS，沸水浴5 min后迅速冷卻，加水2.5 mL，用723型分光光度計(jì)在波長(zhǎng)620 nm 處測(cè)定吸光度。以發(fā)酵液加1%淀粉溶液直接煮沸再加DNS試劑反應(yīng)作為空白對(duì)照[6]。

酶活性定義：在37 ℃，1 mL酶底物反應(yīng)液1 min內(nèi)產(chǎn)生相當(dāng)于1 μg/mL葡萄糖的還原糖量規(guī)定為1個(gè)酶活性國(guó)際單位（1IU）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離篩選結(jié)果

利用篩選培養(yǎng)基從土壤樣品中初步分離獲得產(chǎn)淀粉酶的菌株10株，初步篩選出D/d大于2的6株產(chǎn)淀粉酶能力較強(qiáng)的菌株（表1）。由表1可見，GD-6菌株的D/d最大，其次是GD-3、GD-4菌株，D/d大表明該菌株產(chǎn)生的淀粉酶分解淀粉能力強(qiáng)，由此初步確定GD-6菌株產(chǎn)淀粉酶能力最強(qiáng)。故以該菌株為試驗(yàn)菌株進(jìn)行產(chǎn)酶條件及酶活性研究。

2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果

用不同葡萄糖濃度與DNS共熱反應(yīng)顯色后，測(cè)出其在620 nm處的吸光度，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。得出回歸方程■=1.531 3x-0.327 5，用于酶活性的測(cè)定。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和計(jì)算公式得：還原糖量（μg/mL）=[（OD620 nm+0.307 5）/1.151 3]×1 000，則酶活性=還原糖濃度/[作用時(shí)間（5 min）×粗酶液（0.5 mL）]

2.3 最適產(chǎn)酶溫度的確定結(jié)果

利用GD-6菌株分別在10、15、20、25、30、35、 40 ℃下，pH 7.0，160 r/min搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，以發(fā)酵液作為粗酶液進(jìn)行低溫淀粉酶活性測(cè)定，然后在波長(zhǎng)620nm處進(jìn)行吸光度測(cè)定并計(jì)算酶活性。反應(yīng)溫度對(duì)酶活性的影響見圖2。由圖2可知， GD-6菌株最適產(chǎn)酶溫度為20 ℃，在20 ℃條件下培養(yǎng)產(chǎn)酶活性可達(dá)420.9 IU/（mL·min），產(chǎn)酶能力最強(qiáng)。

2.4 最適產(chǎn)酶pH的確定

在酶活性測(cè)定反應(yīng)體系中，在最適作用溫度（20 ℃）下，利用GD-6分別在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0條件下進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，以發(fā)酵液作為粗酶液進(jìn)行酶活性測(cè)定，在波長(zhǎng)620 nm處進(jìn)行吸光度測(cè)定并計(jì)算酶活性。pH對(duì)酶活性的影響見圖3。由圖3可知，GD-6菌株所產(chǎn)淀粉酶的活性在20 ℃、pH 7.0的培養(yǎng)條件下最高，為420.6 IU/（mL·min）。

3 結(jié)論

高黎貢山百花嶺南齋公房海拔3 150 m，年平均氣溫在15 ℃左右，最低氣溫為達(dá)-6 ℃，屬高海拔高寒地區(qū)，有利于低溫微生物的生長(zhǎng)。通過對(duì)該地區(qū)土樣的研究，得到了6株產(chǎn)淀粉酶能力較強(qiáng)的菌株，編號(hào)為GD-1、GD-2、GD-3、GD-4、GD-5、GD-6；通過比較透明圈有效值的大小初步判斷產(chǎn)酶活性，選取GD-6為研究菌株進(jìn)行低溫下產(chǎn)淀粉酶能力的研究。最終確定GD-6菌株最適產(chǎn)酶溫度為20 ℃，最適產(chǎn)酶pH 7.0，160 r/min搖瓶培養(yǎng)24 h后，酶活性可達(dá)420.9 IU/（mL·min）。

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