摘要：通過藥理學試驗和暗誘導調(diào)控的蠶豆葉片氣孔運動變化分析，來證明異源三聚體GTP-結(jié)合蛋白（G蛋白）參與暗誘導的氣孔關(guān)閉過程。結(jié)果表明，百日咳毒素能夠阻止暗誘導的氣孔關(guān)閉，而該效應(yīng)同樣可被H2O2清除劑維生素C、過氧化氫酶所實現(xiàn)。表明暗中活化的G蛋白水平較高，G蛋白與H2O2共同在暗誘導的氣孔關(guān)閉中作為信號分子參與其中。

關(guān)鍵詞：G蛋白；氣孔運動；信號轉(zhuǎn)導

中圖分類號：Q513+.1；Q945.19；Q67 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）04-0840-02

Role of G Protein in Darkness-Regulated Stomatal Movement

ZHANG Yuan-hua

（College of Chemistry and Life Sciences， Weinan Normal University， Weinan 714000， Shaanxi， China）

Abstract： By pharmacological approach and stomatal analysis， the role of Heterotrimeric GTP binding protein （G protein） in darkness-regulated stomatal movement in Vicia faba L. was explored. It was showed that PTx blocked stomatal closure in darkness， which could also be modulated by H2O2 scavenger vitamin C and catalase， indicating that activated G protein was at high level in darkness； and both G protein and H2O2 acted as signal molecular in the darkness-induced stomatal movement. Key words： G protein； stomatal movement； signal transduction

異源三聚體GTP-結(jié)合蛋白（Heterotrimeric GTP binding protein）簡稱G蛋白，由α、β及γ3個亞基構(gòu)成，是真核細胞中一種參與多種信號傳遞的重要分子開關(guān)[1]。研究證明，α亞基通過構(gòu)象改變使三聚體解離，從而調(diào)控下游的效應(yīng)器，產(chǎn)生第二信使，進而引發(fā)胞內(nèi)相關(guān)基因的表達，最終誘導細胞完成生理生化反應(yīng)；并在一定條件下再度結(jié)合β與γ亞基，形成非活性的三聚體G蛋白[2]。研究表明，G蛋白除了參與視覺、味覺、嗅覺形成及激素、神經(jīng)遞質(zhì)等多種信號轉(zhuǎn)導途徑外，還參與植物的離子通道調(diào)控、種子萌發(fā)、花粉管伸長等生理過程，并介導植物細胞對植物激素的響應(yīng)[3，4]；然而G蛋白是否參與暗誘導調(diào)控的氣孔運動以及是否存在與其他信號分子的相關(guān)聯(lián)系尚不得知。針對上述問題進行了藥理學試驗，并初步探討了暗誘導調(diào)控的氣孔運動變化，以期為深入揭開植物氣孔運動中的機理及認識信號分子間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料選擇 選取大小一致、子粒飽滿的蠶豆（Vicia faba L.）種子，用0.1%的HgCl2滅菌15 min，自來水沖洗干凈后浸泡24 h，然后在25 ℃人工氣候箱中催芽3～4 d，待胚根長至1 cm時播種于盛有濕沙的瓷盤中并放入溫室中培養(yǎng)；溫室培養(yǎng)條件為光/暗周期14 h/10 h、光照強度300 μmol/（m2·s）、溫度白天25 ℃黑夜18 ℃、空氣相對濕度75%。幼苗生長期間每天澆水1次，無任何水分脅迫。待幼苗生長至3～4周齡時，取其莖頂端完全展開的第一對葉片作為供試材料。

1.1.2 藥品試劑及儀器 G蛋白激活劑霍亂毒素（Cholera toxin，CTx）、百日咳毒素（Pertussis toxin，PTx）均購自美國Sigma公司；緩沖液組分嗎啉乙磺酸[2-（N-Morpholino）ethanesulfonic acid，MES]也購自美國Sigma公司；H2O2清除劑過氧化氫酶（Catalase，CAT）和維生素C及其他試劑為國產(chǎn)分析純。儀器主要是Nikon TE 300倒置熒光顯微鏡，購自日本尼康映像儀器銷售（中國）有限公司。

1.2 藥理學試驗

參照McAinsh等[5]的方法，取蠶豆植株頂端生長良好、完全展開的第一對葉，撕取其下表皮（避開葉脈），然后置于MES-KCl緩沖液（MES 10 mmol/L，KCl 50 mmol/L，pH 6.15）中。用干凈毛刷刷去殘存的葉肉細胞，再將其分割成面積約0.5 cm×0.5 cm大小的表皮條塊。然后將新鮮表皮條塊置于不同濃度的G蛋白激活劑CTx、PTx和H2O2清除劑維生素C及CAT溶液中，在25 ℃、空氣相對濕度80%的培養(yǎng)箱中進行暗處理（暗誘導）。所用CTx和PTx的溶液濃度梯度依次為0（CK）、100、200、300、400、500 ng/mL，維生素C的溶液濃度梯度依次為0（CK）、10、50、100、200 μmol/L，CAT的溶液濃度梯度依次為0（CK）、10，50，100，200 munit/mL。在限定時間內(nèi)于顯微鏡下用測微尺測量葉片氣孔孔徑（μm）。測量時每處理每次隨機選取5個視野，每個視野隨機選取6個氣孔。均重復3次（n=90），所得數(shù)據(jù)以“均值±標準誤”表述，并進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 霍亂毒素對暗處理的葉片氣孔開度的影響

不同濃度霍亂毒素溶液對暗處理的蠶豆葉片氣孔開度影響結(jié)果見圖1，由圖1可見，試驗設(shè)定的霍亂毒素溶液濃度梯度對蠶豆葉片暗處理的氣孔開度的影響不大，只在300 ng/mL以上的溶液濃度里引起很小的氣孔關(guān)閉，且處理濃度間差異不顯著（P>0.05），說明霍亂毒素活化的G蛋白對暗誘導的氣孔運動沒有顯著影響。

2.2 百日咳毒素對暗處理的葉片氣孔開度的影響

不同濃度百日咳毒素溶液對暗處理的蠶豆葉片氣孔開度影響結(jié)果見圖2，由圖2可見，與對照相比，各百日咳毒素溶液濃度均對蠶豆葉片暗處理的氣孔開度產(chǎn)生了影響，而且差異顯著（P<0.05），反映出G蛋白被百日咳毒素活化后可能阻止了暗誘導的氣孔關(guān)閉。

2.3 維生素C、過氧化氫酶分別對暗處理的葉片氣孔開度的影響

不同濃度維生素C溶液對暗處理的蠶豆葉片氣孔開度影響結(jié)果見圖3，不同濃度過氧化氫酶溶液對暗處理的蠶豆葉片氣孔開度影響結(jié)果見圖4。從圖3、圖4可見，與對照相比較，10 μmol/L維生素C溶液、10 munit/mL過氧化氫酶溶液對暗處理的氣孔關(guān)閉沒有產(chǎn)生影響（P>0.05），但大于這些濃度的維生素C溶液和過氧化氫酶溶液均能對暗處理的氣孔關(guān)閉產(chǎn)生影響，而且差異顯著（P<0.05）。這個結(jié)果表明，暗處理后保衛(wèi)細胞自發(fā)產(chǎn)生的H2O2能顯著被維生素C和過氧化氫酶清除掉一部分?？紤]到百日咳毒素對暗誘導氣孔關(guān)閉的影響，我們有理由相信G蛋白與H2O2之間存在某種直接或者間接的信號聯(lián)系。

3 討論

G蛋白在動物和微生物的信號轉(zhuǎn)導途徑中起著重要作用，而且目前已有很多證據(jù)表明植物中也存在G蛋白。研究表明，G蛋白在葉片氣孔運動中參與調(diào)控胞外鈣調(diào)蛋白（Calmodulin，CaM）刺激花粉的萌發(fā)和誘導不依賴光照的編碼1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（Rubisco）小亞基的基因（The small subunits of ribulose 1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，rbcS）表達的過程[4]。G蛋白激活劑霍亂毒素及GTP非水解類似物[Guanosine-5′-（γ-thio）triphosphate，GTPγS]能抑制K+內(nèi)流，GTPγS的作用可被胞質(zhì)Ca2+降至較低水平[6，7]。百日咳毒素在不飽和光照下促進氣孔開放且G蛋白參與胞外CaM信號轉(zhuǎn)導，在游離鈣離子濃度[（Ca2+）cyt]上游起作用以及產(chǎn)生H2O2[8-10]。本試驗結(jié)果表明，在暗誘導氣孔開度的過程中，G蛋白作為信號分子參與其中，較小濃度的百日咳毒素溶液就能誘導氣孔運動。這個結(jié)果提示我們暗誘導的氣孔開度與G蛋白的活化有關(guān)，因而在一定范圍內(nèi)，由暗誘導激活的G蛋白水平相對較高，故對暗處理的霍亂毒素激活的G蛋白表現(xiàn)不敏感。進一步的研究表明，H2O2清除劑維生素C和過氧化氫酶能夠阻止暗誘導的氣孔開度，而該效應(yīng)與G蛋白激活劑百日咳毒素的效果一致，說明H2O2與G蛋白之間存在一定的聯(lián)系，二者都可能處于暗誘導氣孔開度的信號通路中。Chen等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，在胞外CaM誘導的氣孔運動中，霍亂毒素可誘導促進擬南芥[Arabidopsis thaliana（L.）Heynh.]保衛(wèi)細胞內(nèi)H2O2的生成。結(jié)合本試驗的結(jié)果，不難看出蠶豆保衛(wèi)細胞中H2O2可能作為G蛋白的下游信號分子在調(diào)控氣孔運動。

參考文獻：

[1] PIERCE K L，PREMONT R T， LEFKOWITZ R J. Seven-transmembrane receptors [J]. Nai Rev Mol Cell Biol，2002，3（9）：639-650.

[2] JONES A M， ASSMANN S M. Plants： The latest model system for G-protein research [J]. EMBO Rep，2004，5（6）：572-578.

[3] ULLAH H， CHEN J G， WANG S， et al. Role of a heterotrimeric G protein in regulation of Arabidopsis seed germination [J]. Plant Physiology，2002，129（2）：897-907.

[4] MA L G， XU X D， CUI S J， et al. The presence of a heterotrimeric G protein and its role in signal transduction of extracellular calmodulin in pollen germination and tube growth[J]. Plant Cell，1999，11（7）：1351-1364.

[5] MCAINSH M R， CLAYTON H， MANSFIELD T A， et al. Changes in stomatal behavior and guard cell cytosolic free calcium in response to oxidative stress [J]. Plant Physiology，1996，111（4），1031-1042.

[6] FAIRLEY-GRENOT K， ASSMANN S M. Evidence for G-protein regulation of inward K1 channel current in guard-cells of fava-bean [J]. Plant Cell，1991，3（9）：1037-1044.

[7] WU W H， ASSMANN S M. A membrane-delimited pathway of G-protein regulation of the guard cell inward K+ channel[J]. Proc Natl Acad Sci USA，1994，91（14）：6310-6314.

[8] LEE H J， TUCKER E B， CRAIN R C， et al. Stomatal opening is induced in epidermal peels of Commelina communis L. by GTP analogs or pertussis toxin[J]. Plant Physiol，1993，102（1）：95-100.

[9] CHEN Y L， HUANG R， XIAO Y M， et al. Extracellular calmodulin-induced stomatal closure is mediated by heterotrimeric G protein and H2O2[J]. Plant Physiol，2004，136（4）：4096-4103.

[10] LI J H， LIU Y Q， L？譈 P， et al. A signaling pathway linking nitric oxide production to heterotrimeric G protein and hydrogen peroxide regulates extracellular calmodulin induction of stomatal closure in Arabidopsis[J]. Plant Physiology，2009， 150（1）：114-124.