摘要：根據(jù)GenBank中衣原體主要外膜蛋白（MOMP）全基因序列設(shè)計特異性引物，以臨床分離的衣原體病原中提取的衣原體全基因組為模板，利用特異性引物PCR擴(kuò)增得到MOMP全基因序列。通過BLAST比對，結(jié)果顯示其與已提交的豬流產(chǎn)衣原體CG1株的MOMP序列（EU531729）有1個堿基不同。根據(jù)對測序結(jié)果進(jìn)行信號肽序列預(yù)測及內(nèi)切酶位點分析，選用BamHⅠ和SalⅠ雙酶切將目的蛋白序列克隆到表達(dá)載體pET-28a上，得到重組質(zhì)粒pET-28a-MOMP。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E. coli BL21進(jìn)行表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物使用鎳離子親和層析柱進(jìn)行純化得到目的蛋白rMOMP。目的蛋白經(jīng)Western-blot檢測，證明其具有免疫學(xué)活性。

關(guān)鍵詞：豬流產(chǎn)嗜性衣原體；主要外膜蛋白（MOMP）；重組表達(dá)

中圖分類號：S852.67 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）04-0949-04

Cloning and Expression of Major Outer Membrane Protein of Chlamydophila Clinical Strain HB1043 from Swine

YAN Shao-xia1，2，TIAN Yong-xiang1，LIU Ze-wen1，YUAN Fang-yan1，GUO Rui1，DUAN Zheng-ying1，

YANG Ke-li1，MENG li1，ZHOU Dan-na1，LI Shao-wen2

（1. Institute of Animal Husbandry and Veterinary， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064，China； 2. College of Animal Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070，China）

Abstract： Chlamydophila was an obligate intracecullar parasites and could infect human and multiple animals. According to the published complete nucleotide sequence of Chlamydophila major outer membrane protein （MOMP） in the GenBank and the whole genome of Chlamydophila isolated from clinical samples， the whole genome sequence of MOMP gene were obtained by PCR. The PCR product was sequenced and blasted with the committed MOMP sequence （EU531729） from strain CG1 of swine Chiamydophila abortus. The results showed that it had one base different from the CG1 strain. The extinction enzymes sites BamHⅠand SalⅠwere selected for cloning the MOMP sequence to the pET-28a. The restructuring plasmid pET-28α-MOMP were then transfered into E. coli BL21 and expressed. The target protein rMOMP was purified by the Ni Sepharose 6 Fast Flow and proved with immunocompetence by Western-blot.

Key words： Chlamydophila； major outer membrane protein； recombined expression

衣原體是一類細(xì)胞內(nèi)專性寄生的、大小介于細(xì)菌和病毒之間的革蘭氏陰性微生物。衣原體感染在世界范圍內(nèi)均有流行，是一種能夠引起人和動物患病的人畜共患病原體。依據(jù)衣原體核糖體rRNA的序列比對以及多態(tài)性限制性酶切位點的分析，將衣原體科分為衣原體屬和嗜性衣原體屬。

嗜性衣原體屬包含鸚鵡熱嗜性衣原體、流產(chǎn)嗜性衣原體、肺炎嗜性衣原體、家畜嗜性衣原體、貓嗜性衣原體以及豚鼠嗜性衣原體[1]。其中，危害最大的病原體主要是流產(chǎn)嗜性衣原體和鸚鵡熱嗜性衣原體。流產(chǎn)嗜性衣原體是從鸚鵡熱嗜性衣原體中衍生出來的一個新成員，這兩種病原體都可以感染豬、綿羊、山羊、牛等哺乳動物，同時作為一種人畜共患的病原體，經(jīng)常與感染動物接觸的人可經(jīng)呼吸道傳播的途徑發(fā)生感染。人類感染后主要表現(xiàn)為類似流感的病癥，嚴(yán)重時可引起心內(nèi)膜炎、腦炎、肺炎、流產(chǎn)甚至死亡[2]。

近些年來，研究者對衣原體的基因組學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了深入的研究，但是針對衣原體病的診斷目前尚沒有十分成功的試劑盒得以推廣應(yīng)用。根據(jù)以往的研究報道，作為研究熱點的診斷抗原蛋白有主要外膜蛋白（MOMP）、多型性外膜蛋白（POMPs）、熱休克蛋白（HSP）以及脂多糖（LPS）等。其中40 ku的衣原體MOMP占衣原體外膜蛋白的60%以上，具有血清型、亞種、種和屬特異性抗原決定簇，是衣原體病診斷的主要研究抗原[3]。有研究者對流產(chǎn)嗜性衣原體的CP/12株的MOMP、E型沙眼衣原體的MOMP以及雞源鸚鵡熱衣原體的MOMP全長基因進(jìn)行了克隆表達(dá)[4-6]。

本試驗所用的病原為臨床分離病原，是經(jīng)特異性引物進(jìn)行PCR鑒定后的衣原體。經(jīng)雞胚攻毒試驗證明其具有很強的致死性，致死的雞胚病理變化與以往研究報道相符。同時，實驗室對該病原體的16 S/23 S/16-23 S rRNA進(jìn)行擴(kuò)增并經(jīng)分析鑒定其屬于嗜性衣原體屬。在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，其與鸚鵡熱嗜性衣原體和流產(chǎn)嗜性衣原體親緣關(guān)系較近，共用一個節(jié)點，但不與鸚鵡熱嗜性衣原體和流產(chǎn)嗜性衣原體共枝[7]。鑒于該株嗜性衣原體具有很強的致病致死性，本試驗對其主要外膜蛋白進(jìn)行選擇性原核表達(dá)，并驗證其免疫學(xué)活性，以期為下一步開發(fā)豬的衣原體病診斷試劑盒打下理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

豬源衣原體HB1043株表達(dá)載體pET-28a、感受態(tài)細(xì)胞Escherichia coli DH5α、E. coli BL21由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所獸醫(yī)室保存；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ、T4 DNA連接酶、DNA Marker以及PCR反應(yīng)試劑等均購自寶生物工程（大連）有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗豬購自SoutherBiotech；豬衣原體陽性血清為本室衣原體IHA試劑盒（購自湖北省畜牧獸醫(yī)局）檢測呈陽性的豬血清；AxyPrep凝膠回收試劑盒購自杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank中MOMP全基因序列設(shè)計特異性引物上游P1：TTAGGATCCATGAA

AAAACTCTTGAAATCG，前加酶切位點BamHⅠ；下游P2：GCGGTCGACTTAGAATCTGAATTGAGC，前加酶切位點SalⅠ。引物由生工生物工程（上海）技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.2.2 目的基因擴(kuò)增 使用Biospin細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（Bioer Technology co. Ltd，BSC12S1）提取衣原體基因組。取適量臨床分離株接毒致死的雞胚卵黃囊液于1.5 mL離心管中，3 000 r/min離心10 min，取上清液，再15 000 r/min離心30 min，棄上清液，按照試劑盒操作步驟提取基因組。以提取的衣原體全基因組DNA為模板，特異性的引物P1、P2為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性15 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。采用AxyPrep凝膠回收試劑盒（杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司，AP-GX-50）對PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，測序。

1.2.3 MOMP基因序列及蛋白特性分析 使用DNAStar、SignalP 3.0 Server等軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析，并與GenBank中衣原體的MOMP序列進(jìn)行同源性分析。

1.2.4 構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-28a-MOMP 根據(jù)分析結(jié)果，選用BamHⅠ和SalⅠ對PCR產(chǎn)物及質(zhì)粒pET-28a進(jìn)行雙酶切。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，采用DNA Fragment Purification Kit ver.2.0（寶生物工程（大連）有限公司，DV807A）對酶切產(chǎn)物進(jìn)行回收。

將帶有黏性末端的酶切產(chǎn)物使用T4 DNA連接酶反應(yīng)體系連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α，轉(zhuǎn)化方法按常規(guī)轉(zhuǎn)化步驟進(jìn)行。篩選出陽性克隆后小量搖菌，使用E.Z.N.A.Plasmid Midi Kit Ⅰ（Omega Bio-Tek，D6944-01）試劑盒提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒經(jīng)PCR及酶切鑒定，以確定目的片段正確克隆入載體，重組載體命名為pET-28a-MOMP。

1.2.5 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 上一步中構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET-28a-MOMP轉(zhuǎn)化表達(dá)載體E. coli BL21。按常規(guī)轉(zhuǎn)化方法進(jìn)行。

1.2.6 誘導(dǎo)表達(dá) 將上一步中轉(zhuǎn)化成功的表達(dá)菌E. coli BL21接種LB培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，同時設(shè)置對照組：含空質(zhì)粒pET-28a的E. coli BL21組。具體操作見文獻(xiàn)[8]。

采用SDS-PAGE凝膠配制試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司，AR0138）檢測蛋白質(zhì)表達(dá)情況。誘導(dǎo)表達(dá)過程中所取的樣品均按照常規(guī)方法處理。按試劑盒使用說明配膠，上樣各20 μL，同時加Protein Marker。80 V，40 min后120 V至電泳完成。電泳完畢后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色，觀察蛋白表達(dá)情況。

1.2.7 rMOMP純化 重新誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白rMOMP。具體操作見文獻(xiàn)[8]。

使用Ni Sepharose 6 Fast Flow親和層析柱除去雜蛋白。具體步驟按使用說明書進(jìn)行。最后洗脫時采用咪唑濃度梯度洗脫，咪唑濃度分別為100、200、300 mmol/L的洗脫液洗脫目的蛋白；洗脫完成后加復(fù)性劑使重組蛋白復(fù)性；最后使用蔗糖濃縮蛋白液濃縮；收集蛋白，1.5 mL離心管分裝，-70 ℃保存。其中每個步驟取樣待檢。

SDS-PAGE電泳檢測蛋白表達(dá)及純化情況，拍照。

1.2.8 rMOMP活性檢測 重新誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳結(jié)束后切膠進(jìn)行Western-blot檢測其免疫學(xué)活性，同時做陰性對照，具體操作見文獻(xiàn)[8]。其中陽性組和陰性組所用一抗為經(jīng)IHA試劑盒檢測確定的陽性血清及陰性血清。觀察結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果及分析

使用DNAStar對MOMP測序結(jié)果分析顯示，擴(kuò)增得到的MOMP序列全長為1 176 bp，編碼的蛋白質(zhì)為391個氨基酸，分子質(zhì)量約為42.4 ku。由Protean軟件分析其表面抗原位點如圖1所示。從圖中可看出第20-90位氨基酸殘基之間的區(qū)段雖然抗原性位點較強但是其可能不是表面抗原位點，而在100位、240位以及345位氨基酸殘基處抗原性較強，而且均可能為表面抗原位點。

測序結(jié)果經(jīng)BLAST比對顯示，擴(kuò)增的MOMP與GenBank中流產(chǎn)嗜性衣原體CG1株的MOMP全序列（EU531729）有1個堿基不同，而且此位點突變后CG1株中原有的限制性內(nèi)切酶位點MsⅡ消失；與鸚鵡熱嗜性衣原體C1/97株以及GD株有3個堿基位點不同。

SignalP 3.0 Server分析結(jié)果如圖2，全部391個氨基酸殘基中最有可能為信號肽的是前22個氨基酸殘基。

對序列進(jìn)行限制性酶切位點分析，在271 bp處為限制性內(nèi)切酶BamHⅠ位點，而且經(jīng)此酶切位點切割后后續(xù)堿基序列的讀碼框并未受到影響。結(jié)合前面的分析結(jié)果，將此限制性內(nèi)切酶位點前的序列切除，對后面部分進(jìn)行選擇性表達(dá)。

2.2 PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

以提取的衣原體全基因組為模板，特異性引物P1、P2為引物PCR擴(kuò)增目的蛋白MOMP的全基因片段，其產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳如圖3所示。從圖中可以清晰地找到目的條帶，大小在1 200 bp左右，與預(yù)期大小相符，說明PCR得到了MOMP的全基因片段。

2.3 SDS-PAGE檢測結(jié)果

蛋白純化過程中收集的各階段樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果如圖4。由圖4可知，含有空載體pET-28a的BL21組在誘導(dǎo)前后的蛋白表達(dá)情況基本上沒有不同，只是蛋白量的多少不同；而含有pET-28a-MOMP重組載體的BL21組在經(jīng)加入誘導(dǎo)劑IPTG后在42.4 ku大小處可以明顯觀察到有新的蛋白產(chǎn)生，其大小與目的蛋白rMOMP的預(yù)測大小一致，說明目的蛋白得到很好的表達(dá)；菌體經(jīng)超聲破碎后的上清中沒有目的蛋白，說明目的蛋白是以包涵體沉淀的形式存在的；3個不同咪唑濃度的洗脫液電泳結(jié)果說明咪唑濃度在100 mmol/L時為最佳的洗脫條件；濃縮后的蛋白樣品電泳結(jié)果說明經(jīng)過純化，蛋白溶液中的雜蛋白基本上被除去。

2.4 rMOMP活性檢測結(jié)果

對純化得到的rMOMP進(jìn)行Western-blot試驗，結(jié)果如圖5。由圖5可知，rMOMP與豬衣原體的陽性血清發(fā)生了反應(yīng)，而與陰性血清不反應(yīng)，說明得到的蛋白具有免疫學(xué)活性。

3 小結(jié)與討論

衣原體的外膜結(jié)構(gòu)與其他革蘭氏陰性菌不同，其缺乏肽聚糖成分，由脂多糖代替。整個分子的穩(wěn)定性由40 ku的主要外膜蛋白（MOMP）、富含半胱氨酸的60 ku的大蛋白和12 ku的小蛋白通過廣泛的二硫鍵結(jié)合形成網(wǎng)絡(luò)狀來維持。分子生物學(xué)研究表明MOMP是一種膜孔類蛋白，其結(jié)構(gòu)類似于大腸桿菌的OmpF和PhoE通過疏水性和靜電力結(jié)合形成的三聚體。MOMP的這個三聚體結(jié)構(gòu)是由3個MOMP單體構(gòu)成，在單體內(nèi)部及單體之間存在廣泛的二硫鍵[9]。Rodriguez-Maranon構(gòu)建的MOMP分子模型中，MOMP單體是由16個反向平行的β-卷曲形成的圓桶狀的分子通道結(jié)構(gòu)。MOMP的4個VD區(qū)則位于桶狀結(jié)構(gòu)的外表面，與EB的黏附及進(jìn)入真核細(xì)胞有直接的關(guān)系[10]。許多研究資料均表明，MOMP具有很強的抗原活性而且是制備衣原體疫苗最佳的候選單位[11，12]。

信號肽在蛋白外源表達(dá)過程中對蛋白的產(chǎn)率、降解以及產(chǎn)物加工復(fù)性等都有很大的影響[13]。該試驗對臨床分離的衣原體MOMP全基因片段進(jìn)行了擴(kuò)增、測序以及序列分析。分析結(jié)果顯示，此株衣原體與已報道的CG1株流產(chǎn)嗜性衣原體的MOMP序列有一個堿基突變，而該位點突變后，CG1株中原有的限制性內(nèi)切酶位點MsⅡ消失，關(guān)于該酶切位點的有無對MOMP性質(zhì)的影響有待進(jìn)一步研究分析。同時根據(jù)序列分析結(jié)果將限制性內(nèi)切酶位點BamHⅠ之前部分序列切除后進(jìn)行了誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)純化后通過Western Blot檢測其免疫學(xué)活性，結(jié)果證明試驗中所得到的蛋白仍然具有免疫學(xué)活性。關(guān)于該株衣原體的MOMP可否作為診斷抗原并進(jìn)一步開發(fā)豬衣原體病的檢測試劑盒等問題將在后續(xù)試驗中加以論證。同時該試驗結(jié)果也為衣原體基因工程疫苗的研究提供了理論參考。

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