摘要：以稻草粉和麩皮為主要原料，利用擬康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii）和黑曲霉（Aspergillus niger）（1∶1）混菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素濾紙酶。以初始pH、發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度、接種量、裝樣量、含水量為研究因子，通過對擬康氏木霉和黑曲霉（1∶1）混菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素濾紙酶的最佳發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后的最佳產(chǎn)酶條件為：固體培養(yǎng)基含水量為50%，初始pH 5.0，裝樣量15 g/500 mL，接種量為8%，30 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。

關(guān)鍵詞：固態(tài)發(fā)酵；纖維素濾紙酶（FPA）；擬康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii）；黑曲霉（Aspergillus niger）

中圖分類號：Q939.97 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）04-0889-03

Cellulase-Producing Conditions by Solid-State Fermentation of Mixed Strains

HUANG Fang-Yi，KE Xia

（Department of Biotechnology， Wuhan Bioengineering Institute，Wuhan 430415， China）

Abstract： Cellulase were produced by solid-state fermentation taking straw and wheat bran as the main raw materials by mixed strains Trichoderma pseudokoningii and Aspergillus niger with the ratio of 1∶1. The fermentation conditions such as the initial pH， fermentation time， cultivation temperature， inoculation dose， medium dose and water content were aptimized by orthogonal experiment. The results showed that the optimized producing conditions of cellulose were， water content in medium， 50%； initial pH 5.0； medium dose， 15 g/500 mL； inoculation dose 8%； culture temperature， 30 ℃； fermenting for 5 d.

Key words： solid-state fermentation； cellulase； Trichoderma pseudokoningii； Aspergillus niger

纖維素是一切植物的主要成分，是地球上最豐富最廉價(jià)的可再生資源。如何提高富含纖維素的工農(nóng)業(yè)廢棄物的利用率已成為近年來研究的熱點(diǎn)[1-3]。目前，中國纖維素濾紙酶生產(chǎn)主要是利用純種進(jìn)行單菌固態(tài)或液態(tài)發(fā)酵，而混菌發(fā)酵可相互補(bǔ)充，促進(jìn)纖維素類物質(zhì)的分解，近年來混合菌的作用逐漸受到重視。涂璇等[4]、胡奎娟等[5]、鄒水洋等[6]、王志等[7]、蘇香萍等[8]先后對混菌發(fā)酵產(chǎn)酶進(jìn)行了研究。該研究以纖維素濾紙酶活（FPA）為指標(biāo)，探討了擬康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii）和黑曲霉（Aspergillus niger）混菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素濾紙酶過程中培養(yǎng)條件對產(chǎn)酶的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 擬康氏木霉（Trichoderma pseudokoningii）購于ACCC（中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心），菌株編號30940；黑曲霉（Aspergillus niger）保存于武漢生物工程學(xué)院發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基；固體發(fā)酵培養(yǎng)基：稻草70 g、麩皮30 g、Mandels營養(yǎng)液[（NH4）2SO4 2.5 g，KH2PO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 2.0 g，NaNO3 0.2 g，F(xiàn)eCl3 0.02 g，1 000 mL水，pH 5.0]100 mL?；靹蚝?21 ℃、30 min滅菌備用。

1.2 方法

1.2.1 稻草預(yù)處理 稻草烘干，剪至3 cm左右，經(jīng)烘干粉碎過 80目篩備用。

1.2.2 培養(yǎng)方法 將在斜面上培養(yǎng)3 d的擬康氏木霉菌株和黑曲霉菌株分別稀釋成1.0×107個/mL的孢子懸浮液，分別取1 mL接于100 mL液體種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 r/min培養(yǎng)3 d，將液體種子按10%的接種量（兩菌接種比例為1∶1）接種于固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，攪拌均勻，于28 ℃恒溫培養(yǎng)4 d。

1.2.3 粗酶液的制備 將固體發(fā)酵物加入適量的檸檬酸緩沖液，攪拌均勻，180 r/min搖床振蕩浸提30 min，然后在4 000 r/min離心20 min，用濾布過濾，取上清液即為粗酶液，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 酶活測定方法 總酶活（FPA酶活）單位：1 g固體酶，在50 ℃、pH 5.5條件下，每分鐘水解濾紙底物，產(chǎn)出相當(dāng)于1 μmol葡萄糖的還原糖量，為1個酶活力單位，以I U/g表示[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 初始pH對FPA的酶活的影響

調(diào)節(jié)Mandels營養(yǎng)液pH，在不同初始pH的固體培養(yǎng)基中發(fā)酵4 d，測FPA酶活。由圖1可知，當(dāng)起始pH為 4.0～6.0時，酶活較高，其中，當(dāng)pH為5.0時，F(xiàn)PA酶活最高（218.45 IU/g），與鄺哲師等[10]研究里氏木霉固態(tài)發(fā)酵結(jié)果相似，隨著pH的繼續(xù)上升，酶活呈明顯下降趨勢。

2.2 溫度對FPA酶活的影響

在500 mL錐形瓶中裝入10 g固體培養(yǎng)基和10 mL Mandels營養(yǎng)液分別在不同溫度下培養(yǎng)4 d，測定酶活，溫度對FPA酶活的影響見圖2。由圖2可知，隨著溫度的升高，酶活先逐漸上升，在30 ℃時酶活達(dá)到最高（242.50 IU/g），在30～32 ℃時，溫度對酶活影響不顯著，但當(dāng)溫度繼續(xù)升高時，F(xiàn)PA酶活呈明顯下降趨勢。

2.3 裝樣量對FPA酶活的影響

裝樣量的多少直接影響發(fā)酵過程中的通氣量，裝樣量過高或過低都會影響酶活[11]。向500 mL錐形瓶中分別裝入不同量的固體培養(yǎng)基，不同裝樣量對酶活的影響見圖3。由圖3可知，當(dāng)裝樣量10～20 g/500 mL時，對產(chǎn)酶影響較小，15 g/500 mL時酶活達(dá)到最高（253.90 IU/g），裝樣量低于10 g/500 mL時，不利于菌體均勻生長，營養(yǎng)不充分；裝樣量高于20 g/500 mL時，則易造成菌體缺氧，且生長溫度升高不利于混合菌代謝產(chǎn)酶。

2.4 接種量對FPA酶活的影響

接種量直接影響產(chǎn)酶結(jié)果，接種量過少，菌種生長達(dá)到穩(wěn)定期的時間較長；接種量過多，會導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)不足[12]。按固體培養(yǎng)基的質(zhì)量百分比不同接入擬康氏木霉和黑曲霉菌株，接種量對酶活的影響見圖4。由圖4可知，接種量在4%～8%時，酶活呈上升趨勢，在接種量8%時，酶活達(dá)到最高（263.40 IU/g），之后隨著接種量的繼續(xù)增加，酶活反而降低。

2.5 含水量對FPA酶活的影響

選擇合適的水分比例，在固態(tài)發(fā)酵中顯得尤為重要。由于固態(tài)發(fā)酵時好氧發(fā)酵，水分過多，會影響透氣性，使培養(yǎng)基內(nèi)部散熱困難，且易造成雜菌污染。水分過少，則可能滿足不了菌絲生長的需要，造成產(chǎn)酶活力低下[13]。由圖5可知，當(dāng)培養(yǎng)基的含水量為50%時，PFA酶活達(dá)到最高（304.0 IU/g），當(dāng)含水量達(dá)55%以上時，隨著水量增加，酶活明顯下降。

2.6 培養(yǎng)時間對FPA酶活的影響

真菌生長代謝大致可分為兩個階段，前期以孢子萌發(fā)、菌絲細(xì)胞生長為主，后期（菌絲發(fā)育到一定程度）則以產(chǎn)酶為主，產(chǎn)酶活力最高為發(fā)酵成熟標(biāo)志[14]。發(fā)酵按上述優(yōu)化條件，從第二天開始，每天測FPA酶活，結(jié)果見圖6。第二至五天時，F(xiàn)PA酶活呈上升趨勢，尤其是第三至四天上升趨勢明顯，第五天達(dá)到最高（346.30 IU/g），第四至六天酶活變化不明顯，第五天之后酶活逐漸降低，可能是由于菌絲老化而降低了產(chǎn)酶量[15]。

2.7 對照試驗(yàn)結(jié)果

采用以上優(yōu)化條件進(jìn)行混菌培養(yǎng)，以擬康氏木霉和黑曲霉分別單菌培養(yǎng)為參照（見圖7）。結(jié)果表明，混菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)FPA酶活較單菌發(fā)酵有大幅度提高。

3 小結(jié)與討論

以稻草粉和麩皮為主要原料，研究了初始pH、溫度、裝樣量、接種量、含水量、發(fā)酵時間等條件對擬康氏木霉和黑曲霉（1∶1）混菌固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)FPA酶活的影響。優(yōu)化后的產(chǎn)酶條件為：固體培養(yǎng)基含水量為50%，初始pH 5.0，裝樣量15 g/500 mL，混合接種量為8%，30 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。

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