摘要：脂肪酶是生物脂肪代謝過(guò)程中的重要酶系，在酶工程中具有重要應(yīng)用價(jià)值。本研究利用花生未成熟種子的cDNA文庫(kù)，克隆了3種脂肪酶基因。序列分析表明，花生3種脂肪酶均具有保守的氨基酸序列和催化活性位點(diǎn)，分屬不同的脂肪酶家族。利用半定量RT-PCR對(duì)花生3種脂肪酶進(jìn)行表達(dá)研究表明，它們?cè)诟鹘M織中的表達(dá)模式各不相同，其中AhLipase2在種子萌發(fā)時(shí)期的子葉中表達(dá)量高，可能起到分解儲(chǔ)藏油脂，為幼苗生長(zhǎng)提供營(yíng)養(yǎng)的作用。

關(guān)鍵詞：花生；脂肪酶；基因克??；表達(dá)分析

中圖分類(lèi)號(hào)：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）01-0001-08

三酰甘油脂肪酶廣泛存在于生物體中，其主要功能是將三酰甘油（TAG）水解成甘油和游離的脂肪酸，同時(shí)具有水解和轉(zhuǎn)?；幕钚浴Ｔ谟土献魑锓N子萌發(fā)過(guò)程中，種子儲(chǔ)藏油脂的分解為幼苗生長(zhǎng)提供能量和碳骨架。脂肪酶催化脂肪分解的第一步反應(yīng)，對(duì)于種子萌發(fā)和萌發(fā)后幼苗的生長(zhǎng)具有重要意義。油料作物種子在儲(chǔ)藏過(guò)程中因?yàn)閿D壓等原因可能引起脂肪分解的啟動(dòng)，導(dǎo)致游離脂肪酸的積累，也是脂肪酶作用的結(jié)果，這些游離脂肪酸的氧化和降解作用導(dǎo)致食物的酸敗降低種子質(zhì)量，并且影響了種子提取的食用油的質(zhì)量。脂肪酶不僅是生物生理過(guò)程的重要酶系，還具有重要的工業(yè)利用價(jià)值。多種真菌和細(xì)菌來(lái)源的脂肪酶被分離純化，并廣泛應(yīng)用于去垢劑、食品、造紙、有機(jī)合成、生物催化等方面[1]。

脂肪酶是脂肪代謝的重要酶系。在種子形成后期，TAG被儲(chǔ)存在種子油體中，由磷脂單分子層包被，脂肪酶只有附著在油水分界面時(shí)才會(huì)起作用[2]。種子萌發(fā)時(shí)期，磷脂酶使油體的磷脂單分子層產(chǎn)生缺陷，使脂肪酶能夠與TAG底物結(jié)合[3]。三酰甘油脂肪酶能夠在油/水表面將TAG水解成自由的脂肪酸和甘油，自由脂肪酸進(jìn)入乙醛酸循環(huán)體，最終轉(zhuǎn)變成葡萄糖，為幼苗初期的生長(zhǎng)提供能量[4]。但脂肪酶與脂肪相互作用的機(jī)理還不甚清楚，是脂肪代謝研究的重要問(wèn)題[5]。在植物中，從玉米、蓖麻 （Ricinus communis）和紫苑草 （Vernonia galamensis）等種子中已經(jīng)純化出脂肪酶[6，7]。近年來(lái)，一些在植物中編碼三酰甘油脂肪酶活性蛋白的基因被克隆[8～11]。對(duì)于植物來(lái)源的脂肪酶，一般根據(jù)N端序列可以將其分為三類(lèi)，第一類(lèi)存在于葉綠體中，第二類(lèi)缺少N端信號(hào)序列，可能分布于胞質(zhì)溶膠，第三類(lèi)分布于線粒體中[12]。

目前商業(yè)化的脂肪酶主要來(lái)源于微生物，而植物脂肪酶具有潛在的重要價(jià)值，如利用植物脂肪酶來(lái)轉(zhuǎn)化植物油脂，生產(chǎn)生物柴油等[13]。花生是重要的油料作物，種子含油量高達(dá)50%以上，其中的三酰甘油為種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)提供了充足的養(yǎng)分，脂肪酶在種子發(fā)育和萌發(fā)過(guò)程中起重要的作用。另外，脂肪酶還關(guān)系到花生的儲(chǔ)存和籽粒的品質(zhì)，對(duì)下游加工具有重要影響。本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)對(duì)花生脂肪酸合成過(guò)程的基因進(jìn)行了詳細(xì)分析[14～16]，本研究對(duì)脂肪降解酶基因進(jìn)行克隆和分析，為全面了解花生油脂代謝奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

11植物材料

本研究以大田種植的魯花14號(hào)花生品種為材料，收集不同發(fā)育時(shí)期的種子，在液氮中速凍，保存于-80℃超低溫冰箱中，用于RNA的提取和cDNA文庫(kù)的構(gòu)建。在盆栽條件下取萌發(fā)7天的花生子葉和萌發(fā)15天的真葉、莖、根，從大田生長(zhǎng)的花生植株上收集花、果針和不同發(fā)育時(shí)期的種子在液氮中速凍，保存于-80℃超低溫冰箱中，用于RNA提取和基因表達(dá)的研究。

12試驗(yàn)方法

121文庫(kù)構(gòu)建和EST測(cè)序用于花生cDNA文庫(kù)構(gòu)建的mRNA來(lái)源于不同發(fā)育階段的花生未成熟種子。200～500 mg花生種子用于總RNA 的提取，試驗(yàn)方法按照RNAgent 試劑盒（Promega） 說(shuō)明進(jìn)行。mRNA 的分離和純化按照PolyATtract mRNA Isolation Systems 試劑盒（Promega） 進(jìn)行。cDNA的合成和文庫(kù)構(gòu)建按Stratagene pBluescript II cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒進(jìn)行。從文庫(kù)中隨機(jī)挑取克隆，用EZNA Plasmid Minipreps DNA Purification System（Omega Bio-Tek， USA） 制備質(zhì)粒DNA。純化的質(zhì)粒DNA用作模板，以T3或T7通用引物用BigDye Terminator v31 Cycle Sequencing Kit （ABI） 在ABI 3730XL 測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序。

122花生脂肪酶基因的克隆及序列分析通過(guò)測(cè)序獲得大量花生EST序列。將含有較多不可讀堿基的低質(zhì)量序列、長(zhǎng)度小于300 bp 的序列、載體序列以及引物序列去除。用Cap3軟件對(duì)EST 序列聚類(lèi)分析。將獲得的contig和單個(gè)的EST 序列用BlastX 在最新NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中（http：//wwwncbinlmnihgov/BLAST/）進(jìn)行比對(duì)注釋。用Lasergene SeqMan II Module （DNAStar） （http：//www DNAStarcom） 進(jìn)行編碼序列的預(yù)測(cè)。多序列比較用ClustalW183 software （http：//wwwchembnetorg/software/ClustalWhtml） 進(jìn)行。在不同蛋白序列比較中不同顏色氨基酸殘基的標(biāo)出用BoxShade program （http：//wwwchembnetorg/software/BOX_formhtml） 進(jìn)行。

花生脂肪酶亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)使用TargetP11 Server （http：//wwwcbsdtudk/services/ TargetP/）和 WoLF PSORT（http：//wolfpsortorg/）。

123花生脂肪酶基因的表達(dá)分析從花生根、莖、葉、花、果針、種子以及種子萌發(fā)過(guò)程中的子葉中提取總RNA，以5 μg總RNA為模板，用PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒（TaKaRa）合成第一鏈cDNA。根據(jù)克隆的花生脂肪酶基因序列設(shè)計(jì)基因特異性引物，以cDNA 為模板擴(kuò)增目的基因片段，以花生actin 基因作為陽(yáng)性對(duì)照和模板加樣參考。

2結(jié)果與分析

21花生脂肪酶cDNA序列的克隆

從花生未成熟種子cDNA 文庫(kù)中隨機(jī)挑選克隆，提取質(zhì)粒DNA，以T3和T7通用引物進(jìn)行大規(guī)模EST測(cè)序。對(duì)獲得的近 20 000條花生EST進(jìn)行聚類(lèi)分析，將獲得的contig群和singleton與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列比較，進(jìn)行初步功能注釋。其中3條EST與數(shù)據(jù)庫(kù)中擬南芥等植物的脂肪酶基因有高度的同源性，且含有完整的開(kāi)放讀碼框，分別命名為AhLipase1 （GenBank登錄號(hào)： GU902981），AhLipase2 （GenBank登錄號(hào)： GU902982），AhLipase3 （GenBank登錄號(hào)： GU902983）。AhLipase1基因ORF長(zhǎng)度2 085 bp，編碼蛋白長(zhǎng)度695 aa，相對(duì)分子量783 kD，預(yù)測(cè)的等電點(diǎn)（pI， isoelectric point）為688；AhLipase2基因ORF長(zhǎng)度1 248 bp，編碼蛋白長(zhǎng)度416 aa，相對(duì)分子量457 kD，預(yù)測(cè)的pI為660；AhLipase3基因ORF長(zhǎng)度1 029 bp，編碼蛋白長(zhǎng)度343 aa，相對(duì)分子量382 kD，預(yù)測(cè)的pI為848。各基因的開(kāi)放讀碼框和對(duì)應(yīng)編碼蛋白的序列如圖1所示。

花生3個(gè)脂肪酶蛋白間的差異較大，相互之間的相似性低于50%，而與GenBank中蛋白比對(duì)結(jié)果表明均屬于脂肪酶：AhLipase1與蓖麻（EEF39083）和毛果楊（EEE98509）脂肪酶蛋白相似性達(dá)74%；AhLipase2與苜蓿脂肪酶蛋白（AAR29056）相似性達(dá)81%。AhLipase3與蓖麻的另一脂肪酶蛋白（EEF51361）相似性達(dá)83%，與苜蓿的一個(gè)未知蛋白（ACJ85575）最為相近，相似性達(dá)89%。所以，預(yù)測(cè)花生的3種脂肪酶分別屬于不同的脂肪酶類(lèi)型。

22花生脂肪酶序列分析

不同生物的脂肪酶蛋白均包含10個(gè)氨基酸組成的保守序列位點(diǎn)：[LIV]-X-[LIVAFY]- [LIAMVST]-G-[HYWV]-S-X-G-[GSTAC]，此基序中的絲氨酸為脂肪酶的活性位點(diǎn)，花生3種脂肪酶蛋白均含有此保守序列位點(diǎn)（圖1）。而3種脂肪酶活性位點(diǎn)的氨基酸組成有所不同：AhLipase1為L(zhǎng)QFTGHSLGG，AhLipase2為PHYVGHSLGT，AhLipase3為IWLAGHSLGS。

根據(jù)推導(dǎo)的花生3種脂肪酶蛋白序列，使用TargetP 軟件對(duì)花生脂肪酶的亞細(xì)胞定位進(jìn)行研究，預(yù)測(cè)結(jié)果表明：花生AhLipase1氨基端具有質(zhì)體轉(zhuǎn)運(yùn)肽，轉(zhuǎn)運(yùn)肽由40個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子量約為42 ku，轉(zhuǎn)運(yùn)肽切割位點(diǎn)預(yù)測(cè)在R和S之間（圖1）；AhLipase2 可能為分泌型蛋白，參與次生代謝過(guò)程，氨基端可能具有24個(gè)氨基酸組成的信號(hào)肽，信號(hào)肽切割位點(diǎn)預(yù)測(cè)在G和S之間（圖1）；AhLipase3 氨基端無(wú)轉(zhuǎn)運(yùn)肽，可能存在于細(xì)胞質(zhì)中。

23花生脂肪酶與其他植物來(lái)源的脂肪酶蛋白序列比較

在GenBank蛋白保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(kù)檢索分析表明，3種花生脂肪酶都屬于酯酶和脂肪酶蛋白（Esterases and lipases）超級(jí)家族，均具有Lipase class 3 （Pfam 登錄號(hào)PF01764） 保守結(jié)構(gòu)域。該保守區(qū)域包括一個(gè)由Ser-Asp-His/Glu 組成的三聯(lián)體催化活性中心，該活性位點(diǎn)包埋在蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部，由一個(gè)“蓋子”所覆蓋，使其不能接近底物；當(dāng)?shù)鞍赘街谟退缑鏁r(shí)，“蓋子”會(huì)打開(kāi)，使脂類(lèi)底物接近活性位點(diǎn)。其中的絲氨酸活性位點(diǎn)位于保守序列 [LIV]-X-[LIVFY]-[LIVMST]-G-[HYWV]-S-X-G-[GSTAC]中（圖1），在AhLipase1中，活性位點(diǎn)分別位于：Ser-460、Asp-521 和His-609，AhLipase1保守區(qū)與其他植物脂肪酶的保守區(qū)相似性很高，10個(gè)氨基酸的保守序列與蓖麻和楊樹(shù)中的序列完全相同，其他活性位點(diǎn)周?chē)陌被嵝蛄幸埠鼙Ｊ兀▓D2A）。在AhLipase2中，活性位點(diǎn)分別位于：Ser-187、Asp-266和His-305，其保守序列與其他植物中的對(duì)應(yīng)序列相似，但保守性不如Lipase1中高（圖2B），10個(gè)氨基酸的保守序列的第一位為脯氨酸，不屬于保守序列模式中的典型氨基酸殘基，與大多數(shù)同源序列也不同，但與水稻（BAD09017）（圖2B）、高粱（XP_0022444703）和二穗短柄草（Brachypodium distachyon，XP_003572437）等植物的相應(yīng)氨基酸相同。在AhLipase3中，活性位點(diǎn)分別位于：Ser-164、Asp-254和His-302，與其他植物同源蛋白比較表明，活性位點(diǎn)及其周?chē)男蛄休^保守（圖2C）。

選擇與花生3種脂肪酶同源性較高的其他植物來(lái)源的24個(gè)脂肪酶蛋白進(jìn)行比較，進(jìn)化樹(shù)顯示，在單子葉和雙子葉植物中均有三種脂肪酶的同源蛋白。這些蛋白明顯分為三類(lèi)，其中AhLipase1與AhLipase3所在的大類(lèi)親緣關(guān)系較近。AhLipase1與蓖麻和楊樹(shù)的兩個(gè)蛋白最為相似；AhLipase2與擬南芥的一個(gè)蛋白最相似，與豆科的苜蓿和大豆的兩個(gè)蛋白也較為相似；AhLipase3所在的大類(lèi)中，雙子葉植物和單子葉植物中的脂肪酶明顯分為兩類(lèi)，AhLipase3與苜蓿的兩種脂肪酶蛋白最相似（圖3）。 24花生脂肪酶表達(dá)分析

對(duì)花生中3種脂肪酶基因表達(dá)研究表明，AhLipase1在種子發(fā)育過(guò)程中高表達(dá)，在花生其它組織中表達(dá)量很低，在種子萌發(fā)時(shí)期的子葉中不表達(dá)；結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)肽預(yù)測(cè)的結(jié)果，AhLipase1可能在質(zhì)體上起作用，參與三酰甘油合成與分解的動(dòng)態(tài)過(guò)程。AhLipase2在種子萌發(fā)過(guò)程中高表達(dá)，在花和種子發(fā)育不同時(shí)期也有表達(dá)，在果針中有微弱表達(dá)，而在營(yíng)養(yǎng)器官根、莖、葉中幾乎不表達(dá)。AhLipase3在各種組織中均有表達(dá)，在果針和根中的表達(dá)量相對(duì)較高（圖4）。比較花生3種脂肪酶在RNA水平的表達(dá)模式可以看出，脂肪酶參與花生生長(zhǎng)的全過(guò)程，不同的脂肪酶分工不同，AhLipase2最有可能參與到三酰甘油的分解，為幼苗生長(zhǎng)提供能量。

3討論

隨著基因工程的發(fā)展，近年來(lái)已有多種植物來(lái)源的脂肪酶基因被克隆。但現(xiàn)有的脂肪酶還不能達(dá)到工業(yè)、農(nóng)業(yè)等應(yīng)用的要求，克隆新的脂肪酶基因，改良其性質(zhì)使其高效表達(dá)，滿(mǎn)足工業(yè)、農(nóng)業(yè)應(yīng)用的要求是脂肪酶研究的重要內(nèi)容。本研究克隆的AhLipase2基因預(yù)測(cè)參與到花生種子萌發(fā)時(shí)期降解存儲(chǔ)的油脂，具有生物和工業(yè)研究的價(jià)值。

本研究從花生種子中克隆了3種花生脂肪酶基因，三者序列差異很大，在其他植物中也存在他們各自的同源序列，其RNA水平在不同組織中也各不相同，證明不同的脂肪酶參與到花生生長(zhǎng)發(fā)育的各個(gè)時(shí)期?；ㄉN子含油量高，但不耐儲(chǔ)藏，儲(chǔ)藏過(guò)程中油脂的降解使游離脂肪酸含量增高，導(dǎo)致酸敗使花生口味下降，影響花生油的質(zhì)量?；ㄉ久冈谟椭纸獾牡谝徊狡鹱饔?，研究其作用機(jī)理和調(diào)控因素將為減少花生收后損失奠定理論基礎(chǔ)。

植物中的脂肪酸以多種形式存在，如儲(chǔ)藏的甘油三酯和組成細(xì)胞膜的磷脂，這些脂類(lèi)分解由不同的脂肪酶完成，因此，植物中的脂肪酶組成一個(gè)大的家族，其序列上的差異決定了功能和底物的不同。本研究克隆的脂肪酶是從花生種子cDNA文庫(kù)中得到的，參與種子發(fā)育和萌發(fā)等過(guò)程，花生中可能還存在其他在種子中不表達(dá)或表達(dá)量低的脂肪酶，需要對(duì)這些脂肪酶進(jìn)行全面的克隆分析，并對(duì)脂肪酶的細(xì)胞定位進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證，研究其底物特異性和催化特征，對(duì)其蛋白功能和酶學(xué)特性進(jìn)行進(jìn)一步鑒定，從而確定各個(gè)脂肪酶的功能。

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