摘要：以小麥山融3號(hào)為試驗(yàn)材料，克隆了TaLTR cDNA序列（Low temperature-responsive RNA-binding protein）。序列分析表明，TaLTR序列包含完整的ORF區(qū)，編碼蛋白含有162個(gè)氨基酸，其氨基端包含一個(gè)RRM（RNA recognition domain）超家族保守的結(jié)構(gòu)域，羧基端則富含甘氨酸；經(jīng)半定量RT-PCR分析，表明TaLTR參與低溫、干旱、鹽脅迫逆境反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：小麥；TaLTR基因；RT-PCR；逆境脅迫

中圖分類號(hào)：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）01-0025-05

小麥?zhǔn)羌s35%世界人口的主要糧食，其種植面積約占谷類作物種植總面積的三分之一。低溫、干旱是影響小麥生產(chǎn)的主要非生物脅迫因子，研究小麥對(duì)干旱、低溫等脅迫的響應(yīng)機(jī)制，發(fā)掘逆境應(yīng)答相關(guān)蛋白基因，對(duì)于研究小麥抗逆分子機(jī)制及增強(qiáng)抗逆性具有重要的理論和實(shí)踐意義。

非生物逆境脅迫下，涉及離子轉(zhuǎn)運(yùn)與平衡、細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂、細(xì)胞防御和解毒、能量產(chǎn)生與運(yùn)輸以及滲透調(diào)節(jié)等生理代謝的大量基因的表達(dá)都會(huì)發(fā)生變化[1]。為此，山東大學(xué)夏光敏實(shí)驗(yàn)室利用SSH、基因芯片及雙向電泳-質(zhì)譜分析等方法，對(duì)耐鹽抗旱小麥新品種山融3號(hào)鹽或干旱脅迫前后的表達(dá)譜進(jìn)行了分析，獲得了大量表達(dá)模式發(fā)生變化的基因或ESTs信息[2～4]。本研究從山融3號(hào)鹽脅迫前后的表達(dá)譜芯片結(jié)果中選取1個(gè)表達(dá)變化的EST（EST ID：WL403），對(duì)其進(jìn)行了基因克隆、初步表達(dá)分析。

1材料與方法

11實(shí)驗(yàn)材料

111材料小麥（Triticum aestivum L）品種山融3號(hào)，由山東大學(xué)夏光敏實(shí)驗(yàn)室提供；菌株：大腸桿菌（Escherichia coil） DH5α（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

112試劑Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品；常用內(nèi)切酶、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit為Fermentas公司產(chǎn)品；Taq酶使用寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品Mighty Amp DNA Polymerase （hot start）；pEASY-T3載體為北京全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

12方法

121總RNA提取和cDNA合成Trizol法提取各取樣時(shí)間點(diǎn)的小麥總RNA。根據(jù)Fermentas的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit使用說明，反轉(zhuǎn)錄合成小麥cDNA的第一條鏈。

122TaLTR基因的全長(zhǎng)cDNA克隆分析小麥基因芯片和雙向電泳結(jié)果，篩選小麥EST數(shù)據(jù)庫，從對(duì)應(yīng)ESTs中選擇克隆一個(gè)鹽脅迫下表達(dá)發(fā)生變化的基因。根據(jù)EST文庫中拼接高度同源的ESTs序列，設(shè)計(jì)特異性引物TaLOW-S1/A1，擴(kuò)增獲得153 bp的小片段（TaLOW-S1：5′-TTAGGGTTTAGTAGTAGCGGGG-3′；TaLOW -A1：5′-GTCAGTGATGATCTTGGAGTCG-3′），經(jīng)5′-和3′-RACE擴(kuò)增，拼接后獲得556 bp cDNA序列。利用ORF finder 程序（http：//wwwncbinlmnihgov/gorf/gorfhtml）預(yù)測(cè)拼接序列的開放閱讀框（ORF）。

使用Primer Premier 50 軟件在預(yù)測(cè)的開放閱讀框兩側(cè)設(shè)計(jì)特異引物TaLTR-F1/R1，得到一對(duì)能有效擴(kuò)增TaLTR的引物（TaLTR-F1：5′-GAATGGCGGACGTCGAGT-3′；TaLTR -R1：5′-ATCGGGTAACTAGGATAACTGG-3′），以反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)序。

PCR程序?yàn)椋?8℃ 5 min；98℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，32循環(huán)；72℃ 10 min；16℃保存。

123TaLTR序列分析利用網(wǎng)站資源對(duì)TaLTR基因進(jìn)行序列分析。NCBI進(jìn)行nBLAST同源性比對(duì)；使用http：//auexpasyorg/ tools/dnahtml翻譯TaLTR氨基酸序列；以InterPro Scan為工具分析蛋白質(zhì)序列的結(jié)構(gòu)域；運(yùn)用MEGA31軟件構(gòu)建TaLTR基因編碼蛋白的同源系統(tǒng)進(jìn)化樹；運(yùn)用DNAMAN、clustalX軟件構(gòu)建多重序列比對(duì)圖譜。

124基于半定量RT-PCR的初步表達(dá)分析挑選生長(zhǎng)至兩葉一心、健壯的山融3號(hào)小麥進(jìn)行如下脅迫處理：200 mmol/L NaCl泡根處理72 h，然后恢復(fù)72 h；18% PEG 6000浸根處理72 h，隨后恢復(fù)72 h；對(duì)照為正常條件下同期生長(zhǎng)的健康植株。分別在0、05、1、2、6、12、24、48、72 h恢復(fù)48 h和恢復(fù)72 h取樣，液氮冷凍后-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

取山融3號(hào)小麥植株脅迫處理不同時(shí)間點(diǎn)的根和葉，Trizol法提取RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一鏈為模板，以TaActin-S（5′-AGCCATACCGTGCCAATC-3′）和TaActin-A（5′-AGAGCCTCCAATCCAGAC-3′）作為擴(kuò)增引物，獲得558 bp左右的Actin內(nèi)參產(chǎn)物片段。以TaLTR-S1、TaLTR-A1作為擴(kuò)增引物，獲得153 bp左右目的基因產(chǎn)物。Actin基因PCR程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。以Actin基因獲得的cDNA模板量和循環(huán)次數(shù)、最佳擴(kuò)增程序獲得單一的TaLTR目的產(chǎn)物帶。PCR條件為：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30循環(huán)；72℃ 10 min；4℃保存。

2結(jié)果與分析

21TaLTR基因的cDNA克隆

根據(jù)小麥EST WL403序列在NCBI中搜索與其同源的小麥ESTs序列，共獲得321條序列。將這321條序列和5′-、3′-RACE擴(kuò)增序列進(jìn)行拼接獲得1個(gè)長(zhǎng)度為689 bp的contig。進(jìn)一步設(shè)計(jì)特異性引物TaLTR-F1和TaLTR-R1擴(kuò)增包括完整ORF的cDNA序列，得到約556 bp的產(chǎn)物（圖1），命名為TaLTR（GI：Kc408381）。回收目標(biāo)擴(kuò)增產(chǎn)物克隆到pEASY-T3載體中，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切驗(yàn)證（圖2）和序列測(cè)定，測(cè)序結(jié)果及推導(dǎo)的氨基酸序列見圖3。

22TaLTR基因的序列分析和同源性比較

對(duì)獲得的556 bp cDNA序列初步分析表明，該序列包含完整的ORF區(qū)，預(yù)測(cè)編碼的蛋白含有162個(gè)氨基酸。運(yùn)用ExPasy、InterPro網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，TaLTR基因編碼的蛋白氨基端包含一個(gè)RRM（RNA recognition motif domain）超家族保守的結(jié)構(gòu)域，羧基端則富含甘氨酸（圖4）。

將TaLTR基因推導(dǎo)預(yù)測(cè)的氨基酸序列在NCBI上作BLAST比較，結(jié)果顯示，其RRM結(jié)構(gòu)域氨基酸與小麥TaGRP2、大麥GRP HORVU、水稻OsGRP1、玉米grp1、擬南芥AtGRP7的RRM結(jié)構(gòu)域氨基酸序列一致性分別為99%、99%、79%、81%、81%，說明該結(jié)構(gòu)域具有較強(qiáng)的保守性（圖5）。運(yùn)用MEGA31軟件構(gòu)建了TaLTR基因編碼的蛋白與其他物種同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果表明，來源于單子葉植物的蛋白序列與雙子葉植物的同源蛋白明顯分為兩支，而在單子葉植物這一支上TaLTR與小麥TaGRP2、大麥GRP HORVU聚在一起（圖6）。

迄今為止，尚未見對(duì)小麥TaGRP2和大麥GRP HORVU基因功能研究的報(bào)道。對(duì)擬南芥同源基因AtGRP7基因功能的研究發(fā)現(xiàn)，AtGRP7是冷脅迫過程中的一個(gè)RNA伴侶因子，其N-端的RRM結(jié)構(gòu)域在冷脅迫適應(yīng)過程中起關(guān)鍵作用[5]。研究還發(fā)現(xiàn)，AtGRP7基因通過抑制開花抑制子FLC的表達(dá)控制植物由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)到生殖生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)換[6]。不同物種的TaLTR同源蛋白的RRM結(jié)構(gòu)域具有極高的保守性，預(yù)示它們?cè)诠δ苌峡赡芤簿哂心承┫嗨菩?。小麥TaLTR基因是否具有擬南芥AtGRP7基因同樣的功能還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

23基于半定量RT-PCR的TaLTR基因在干旱、鹽和低溫脅迫下的初步表達(dá)分析

無論在根中還是在葉中，干旱、高鹽和低溫脅迫都可誘導(dǎo)TaLTR基因的表達(dá)量增加。18% PEG6000和200 mmol/L NaCl誘導(dǎo)的TaLTR基因表達(dá)在受脅迫6～12 h達(dá)到峰值，之后會(huì)逐漸下降恢復(fù)到正常水平（圖7A、7B和7D、7E）；而該基因的表達(dá)在4℃低溫處理05 h到72 h持續(xù)升高，恢復(fù)到室溫后基因表達(dá)量也相應(yīng)恢復(fù)到原有水平（（圖7C和7F）。上述結(jié)果表明，TaLTR基因可以應(yīng)答干旱和高鹽的脅迫，但其表達(dá)增強(qiáng)時(shí)間很短，有可能是一種應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)果；而在小麥適應(yīng)冷脅迫過程中，該基因無論根中還是葉中表達(dá)量持續(xù)升高，推測(cè)它在應(yīng)答低溫脅迫中起更重要作用。結(jié)合序列同源性分析的結(jié)果，初步推測(cè)，TaLTR基因在小麥冷脅迫適應(yīng)過程中，可能與小麥花期轉(zhuǎn)換、調(diào)控春化作用相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān)。

3結(jié)論

本研究克隆了小麥山融3號(hào)TaLTR基因，通過對(duì)其進(jìn)行序列分析以及RT-PCR半定量初步表達(dá)分析，推測(cè)TaLTR基因可能在應(yīng)對(duì)低溫脅迫時(shí)起到重要作用。該基因同時(shí)還受到高鹽和干旱脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)。TaLTR基因具體行使哪些功能，是否可調(diào)控春化相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)而影響植物開花時(shí)間，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。這些問題的解決或許將有助于揭示作物低溫應(yīng)答機(jī)制，為研究小麥抗逆生理機(jī)制以及抗逆育種提供基礎(chǔ)材料。

參考文獻(xiàn)：

[1]單雷， 趙雙宜， 夏光敏 植物耐鹽相關(guān)基因及其耐鹽機(jī)制研究進(jìn)展 [J]分子植物育種， 2006， 4（1）： 15-22

[2]Peng Z Y， Wang M C， Li F， et al A proteomic study of the response to salinity and drought stress in an introgression strain of bread wheat [J] Mol Cell Proteomics， 2009， 8（12）： 2676-2686

[3]Liu C， Li S， Wang M C， et al A transcriptomic analysis reveals the nature of salinity tolerance of a wheat introgression line [J] Plant Mol Biol， 2012， 78（1-2）： 159-169

[4]Wang M C， Peng Z Y， Li C L， et al Proteomic analysis on a high salt tolerance introgression strain of Triricum aestivum/Thinopyrum ponticum [J] Proteomics， 2008， 8（7）： 1470-1489

[5]Kwak K J， Park S J， Han J H， et al Structural determinants crucial to the RNA chaperone activity of glycine-rich RNA-binding proteins 4 and 7 in Arabidopsis thaliana during the cold adaptation process [J] Journal of Experimental Botany， 2011， 62（11）： 4003–4011

[6]Streitner C， Danisman S， Wehrle F， et alThe small glycine-rich RNA bingding protein AtGRP7 promotes florals transition in Arabidopsis thaliana [J] Plant J， 2008， 56（2）： 239-250