摘要：以鄭單21為試驗材料，利用透射電鏡（TEM： Transmission Electron Microscope）和激光粒度分析儀研究水分脅迫下玉米胚乳淀粉粒的形態(tài)和粒度分布。結(jié)果表明：水分脅迫導(dǎo)致玉米籽粒形態(tài)建成滯后，尤其是內(nèi)、外珠被組織解體和胚乳淀粉粒積累的速度減緩。授粉后7天，水分脅迫處理的籽粒外珠被尚未退化消失，果皮、內(nèi)珠被和胚乳細胞的界限模糊，幾乎每個果皮細胞內(nèi)都含有細胞核；而正常供水處理的玉米籽粒外珠被已退化消失，果皮、內(nèi)珠被和胚乳細胞的界限清晰，果皮細胞內(nèi)容物較少，細胞壁較薄，內(nèi)珠被細胞明顯較大，內(nèi)容物少，絕大多數(shù)細胞無細胞核。授粉后11天，兩處理的胚乳細胞的細胞壁明顯變薄，細胞內(nèi)容物顯著增多，細胞內(nèi)已明顯可見大大小小的淀粉粒，但正常供水處理的淀粉粒明顯大且多。水分脅迫處理的淀粉粒表面積、數(shù)目和體積分布均呈單峰曲線，而正常供水處理表現(xiàn)為淀粉粒數(shù)目分布呈單峰曲線，表面積分布和體積分布呈雙峰曲線。水分脅迫可降低A型淀粉粒的表面積、數(shù)目和體積百分比，增加B型淀粉粒的表面積、數(shù)目和體積百分比。

關(guān)鍵詞：高淀粉玉米；淀粉粒發(fā)育；粒度分布；水分脅迫

中圖分類號：S513.01文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）01-0054-06

玉米是我國重要的糧食作物，常年種植面積約2 400×104 hm2，50%以上種植在東北、西北、西南地區(qū)依靠自然降水、缺水的旱地上。玉米的生長發(fā)育受遺傳特性和各種環(huán)境因素的影響，在其遭受的諸多自然災(zāi)害中，尤以干旱最為嚴重，由于水分脅迫導(dǎo)致的減產(chǎn)，超過其它因素造成減產(chǎn)的總和[1]。

淀粉是玉米籽粒中的主要積累物質(zhì)，占籽?？傊氐?0%左右，其數(shù)量多寡直接影響玉米產(chǎn)量和品質(zhì)。玉米淀粉是人類主要的淀粉來源之一，也是工業(yè)淀粉和以淀粉為原料的深加工產(chǎn)業(yè)的主要原料。全世界淀粉年產(chǎn)量為1 600×104 t，其中80%以上是玉米淀粉，美國95%以上淀粉來自于玉米，我國淀粉行業(yè)90%以玉米為原料。玉米淀粉的生產(chǎn)在整個玉米加工業(yè)中占十分重要的地位[2]。

玉米胚乳淀粉粒的發(fā)育不僅受控于遺傳因子，同時也受環(huán)境因素的制約。關(guān)于玉米籽粒淀粉積累與基因型及環(huán)境因素的關(guān)系，前人已做了較深入的研究[3～16]。但有關(guān)高淀粉玉米在不同供水條件下籽粒淀粉粒發(fā)育規(guī)律、形態(tài)結(jié)構(gòu)及粒度分布特征的研究尚少見報道。為此，本研究以高淀粉玉米為材料，比較研究了高淀粉玉米在不同供水條件下，籽粒淀粉粒的動態(tài)變化以及淀粉粒度分布特征，旨在為高淀粉玉米產(chǎn)量提高和節(jié)水栽培提供理論依據(jù)。

1材料與方法

11試材與試驗設(shè)計

試驗于2010年6月～2011年10月在山東省六一農(nóng)場人工旱棚內(nèi)進行。旱棚高35 m，棚頂用透光率89%的陽光板覆蓋，棚四周為通風(fēng)良好的鐵制防護網(wǎng)。每處理選用統(tǒng)一規(guī)格的瓷盆25個，完全隨機排列，瓷盆上口徑、下口徑和盆高分別為40、38 cm和40 cm。供試材料為鄭單21（粗淀粉含量為7542%），6月5日播種，每盆播種4粒，留苗1株。試驗設(shè)水分脅迫（土壤含水量為田間持水量的40%～45%）和正常供水（土壤含水量為田間持水量的65%～70%）2個處理。處理時間為6月20日（三葉期）至8月8日（吐絲期），處理期間每次灌水前采用烘干法控制土壤含水量，之后所有處理正常供水（土壤含水量為田間持水量的65%～70%）。

12取樣及測定方法

剝?nèi)∈诜酆?、7、11、15 天的玉米果穗中部籽粒，切取胚與花柱遺跡之間的籽粒橫切面用4%戊二醛前固定，磷酸緩沖液沖洗；再用1%鋨酸后固定，乙醇梯度脫水；Epon-812 （環(huán)氧樹脂）浸透與包埋；LKB-7800型超薄切片機切片，切片厚06 μm。部分切片放到載玻片上，加熱至60℃展片，吸干水分，干燥后在60℃下用堿性品紅-亞甲基藍染色液染色，BX-51型OLMPUS熒光顯微鏡觀察及數(shù)碼照相，進行籽粒種皮形態(tài)建成和淀粉粒分布研究。部分材料在定位后用醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色，JEM-1200EX型透射電鏡下觀察照相，用于淀粉粒超微結(jié)構(gòu)研究。

13玉米籽粒淀粉提取

參考Raeker[17]、Peng[18]和Stoddard[19]的淀粉提取方法：取保存待用的各處理授粉后15 天的籽粒5 g，加入05 mol/L NaCl 25 ml，置于4℃冰箱中48 h，去除籽粒的果皮和胚，置于研缽中加入05 mol/L NaCl 溶液研磨，直至有面筋析出，過濾。將未濾過物多次研磨過濾，直至濾出液用碘試劑染色不顯藍色為止。合并濾液，3 000 r/min離心10 min，取沉淀。沉淀再分別用2 mol/L NaCl、2% SDS 和02% NaOH 溶液順序振蕩沖洗，去除蛋白質(zhì)，直至沉淀為白色為止。最后沉淀用丙酮振蕩沖洗3遍，40℃烘干，磨細，貯藏備用。每個樣品重復(fù)2次。

14淀粉粒度分布的測定

利用LS13320 型激光粒度分析儀（貝克曼庫爾特公司）測定，采用其通用液體樣品池，所用液體為蒸餾水。具體試驗方法如下：稱取005 g 淀粉樣品，加入5 ml 蒸餾水振蕩分散成懸濁液，得待測液。打開儀器，調(diào)節(jié)泵速為45 r/min，設(shè)運行時間為35 s，選Fraunhofertf 780z 光學(xué)模型，檢測儀器背景和光路中心，然后注入1 ml 待測液，待遮蔽率顯示OK后開始分析。每個樣品重復(fù)3～5 次。

15統(tǒng)計分析與作圖

應(yīng)用DPS 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析；利用Excel 軟件和LS13320 型激光粒度分析儀自帶軟件進行作圖。

2結(jié)果與分析

21高淀粉玉米籽粒發(fā)育動態(tài)

授粉后7 天，水分脅迫處理的玉米籽粒發(fā)育明顯落后于正常供水處理，其外珠被和內(nèi)珠被均尚未退化消失（圖1），果皮約有20～40層細胞，其最外幾層細胞呈扁長形，含有明顯的細胞核；越靠近內(nèi)層的細胞越小，至接近外珠被時，細胞已基本成圓形小顆粒。內(nèi)珠被由2層細胞組成，每層細胞大小基本一致，細胞中內(nèi)容物相對較少，無細胞核，細胞呈扁長形，排列有序。與內(nèi)珠被緊密相連的是一層大小整齊一致且有核的細胞，其內(nèi)為多層大小不一、形狀不規(guī)則的細胞組成的珠心。珠心細胞表現(xiàn)為最外層細胞小，且顏色較深，內(nèi)層細胞大，細胞呈透明狀。而正常供水處理的玉米籽粒發(fā)育較快，其外珠被已退化消失，內(nèi)珠被由三層細胞組成，細胞明顯較大，內(nèi)容物少，絕大多數(shù)細胞無細胞核，其與珠心相連部位的細胞顏色較深，呈一明顯的黑色分界線。珠心組織與水分脅迫處理的形態(tài)差異不明顯?？梢姡痔幚韺τ衩鬃蚜０l(fā)育的影響主要體現(xiàn)在形態(tài)建成的速度，尤其是內(nèi)、外珠被組織解體的速度上。

授粉后11天，水分脅迫與正常供水處理的果皮、外珠被、內(nèi)珠被、珠心和胚乳細胞的形態(tài)、數(shù)量和內(nèi)容物等均發(fā)生顯著變化（圖1）。其中，果皮的內(nèi)層細胞已開始解體，僅水分脅迫處理的少數(shù)細胞內(nèi)可見細胞核；細胞體積明顯增大，數(shù)量大幅減少。外珠被細胞也變得支離破碎，但外珠被和內(nèi)珠被組織界線清晰可辨，內(nèi)珠被細胞已彼此離散，細胞質(zhì)和細胞核解體，細胞被破壞，正常供水處理的內(nèi)珠被里幾乎無完整細胞存在。而胚乳細胞的細胞壁明顯變薄，細胞內(nèi)容物顯著增多，細胞內(nèi)已明顯可見大大小小的淀粉粒，且越靠近胚乳內(nèi)層，細胞中的淀粉粒越大、數(shù)量越多。處理間比較可見，水分脅迫處理內(nèi)外珠被退化消失的速度明顯低于正常供水處理，且正常供水處理胚乳淀粉粒的數(shù)目和大小均顯著大于水分脅迫處理。說明，水分不僅可顯著影響玉米內(nèi)外珠被降解的速度，也顯著影響籽粒胚乳中淀粉粒的積累。

授粉后15天，兩處理的果皮細胞層數(shù)均明顯減少，細胞內(nèi)幾乎已無內(nèi)容物存在，內(nèi)外珠被均已慢慢降解并濃縮成一條黑線，緊緊貼在一起與胚乳的糊粉層細胞相連。糊粉層細胞中含有大量的油脂，呈褐色。糊粉層以內(nèi)的胚乳細胞中含有大量的淀粉粒，淀粉粒的體積和數(shù)量較授粉后11天明顯增加。處理間仍表現(xiàn)為：正常供水處理的淀粉粒明顯比水分脅迫處理大且多（圖1）。

22胚乳淀粉粒粒度分布特征

221淀粉粒的表面積分布水分對玉米淀粉粒的表面積分布有較大影響，水分脅迫處理玉米胚乳淀粉粒的表面積分布表現(xiàn)為單峰曲線，峰值出現(xiàn)在2107 μm；而正常供水處理的胚乳淀粉粒表面積分布表現(xiàn)為雙峰曲線，峰值分別出現(xiàn)在1204 μm和1029 μm（圖2）。其中，水分脅迫處理B型（直徑<10 μm）淀粉粒的表面積占總數(shù)的100%，而正常供水處理B型淀粉粒的表面積約占總數(shù)的86%，A型（直徑>10 μm）淀粉粒占14%左右。與正常供水處理相比，水分脅迫處理<40 μm的淀粉粒表面積百分比顯著增加，達4794%，其中10～20 μm和20～40 μm的淀粉粒表面積百分比分別增加3378%和35816%；而<10 μm、40～100 μm和>10 μm的淀粉粒表面積百分比均顯著降低，分別降低7512%、5984%和100%（表1）。說明，水分脅迫處理B型淀粉粒的表面積百分比的增加主要是20～40 μm淀粉粒表面積百分比的顯著增加所致，而A型淀粉粒的表面積百分比的降低主要是>10 μm淀粉粒表面積百分比的顯著降低所致。水分脅迫可降低A型淀粉粒的表面積百分比，增加B型淀粉粒的表面積百分比。

223胚乳淀粉粒體積分布水分對玉米胚乳淀粉粒的體積分布亦有很大影響，其中水分脅迫處理的體積分布呈單峰曲線，峰值出現(xiàn)在306 μm，而正常供水處理呈雙峰曲線，峰值分別出現(xiàn)在1322 μm和1129 μm（圖4）。處理間比較可見，水分脅迫處理B型淀粉粒的體積占總數(shù)的100%，而正常供水處理B型淀粉粒的體積占總數(shù)的6130%，A型占3870%。與正常供水處理相比，水分脅迫處理<60 μm的淀粉粒體積百分比顯著增加，高達22078%，其中06～20 μm和20～60 μm分別增加10971%和31149%，<06 μm的淀粉粒體積百分比降低100%。而水分脅迫處理>6 μm的淀粉粒體積百分比較正常供水處理降低9827%，其中60～100 μm和>6 μm分別降低9607%和100%（表3）。

缺氮缺水，SS活性在授粉后20～30天峰值較低，SPS活性甚至在授粉后20天沒有峰值出現(xiàn)，意味著玉米葉片中SS、SPS活性受到嚴重抑制，導(dǎo)致了源端生產(chǎn)的用于淀粉合成的蔗糖數(shù)量減少，籽粒淀粉的積累量因此受到抑制；缺氮缺水使籽粒中的淀粉代謝酶SSS、GBSS、ADPG-PPase、UDPG-PPase活性過早下降，導(dǎo)致淀粉合成過程中酶系統(tǒng)的紊亂，抑制淀粉生物形成的正常進行，降低籽粒淀粉含量[20～23]。

本試驗結(jié)果表明，水分脅迫導(dǎo)致玉米籽粒形態(tài)建成滯后，尤其是內(nèi)、外珠被組織解體和胚乳淀粉粒積累的速度減緩。授粉后7天，水分脅迫處理的玉米籽粒外珠被尚未退化消失，果皮、內(nèi)珠被和胚乳細胞的界限模糊，幾乎每個果皮細胞內(nèi)都含有細胞核；而正常供水處理的玉米籽粒外珠被已退化消失，果皮、內(nèi)珠被和胚乳細胞的界限清晰，果皮細胞內(nèi)容物較少，細胞壁較薄，內(nèi)珠被細胞明顯較大，內(nèi)容物少，絕大多數(shù)細胞無細胞核。授粉后11天，兩處理的胚乳細胞的細胞壁明顯變薄，細胞內(nèi)容物顯著增多，細胞內(nèi)已明顯可見大大小小的淀粉粒，但正常供水處理的淀粉粒明顯大且多。授粉后15天，糊粉層以內(nèi)的胚乳細胞中含有大量的淀粉粒，淀粉粒的體積和數(shù)量較授粉后11天明顯增加，且仍表現(xiàn)為正常供水處理的淀粉粒明顯比水分脅迫處理大且多。

水分脅迫處理的淀粉粒表面積、數(shù)目和體積分布均呈單峰曲線，而正常供水處理表現(xiàn)為淀粉粒數(shù)目分布呈單峰曲線，表面積分布和體積分布呈雙峰曲線。水分脅迫可降低A型淀粉粒的表面積、數(shù)目和體積百分比，增加B型淀粉粒的表面積、數(shù)目和體積百分比。

綜上所述，水分脅迫抑制了高淀粉玉米籽粒淀粉粒的發(fā)育，降低了籽粒淀粉的積累量。這為進一步研究水分脅迫復(fù)水后高淀粉玉米胚乳淀粉粒發(fā)育的補償生長機制及高淀粉玉米的高產(chǎn)、抗旱栽培提供了初步的理論依據(jù)。參考文獻：

[1]劉樹堂，東先旺，孫朝輝，等水分脅迫對夏玉米生長發(fā)育和產(chǎn)量形成的影響[J]萊陽農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2003，20（2）：98-100

[2]段民孝，趙久然，王元東，等玉米子粒淀粉研究進展[J]玉米科學(xué)，2002，10（1）：29-32

[3]王忠孝，高學(xué)曾，許金芳，等關(guān)于玉米籽粒敗育的研究[J]中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1986，6：36-40

[4]王忠孝，杜成貴，王慶成不同類型玉米籽粒灌漿過程中主要品質(zhì)成分的變化規(guī)律[J] 植物生理學(xué)通訊，1990，1：30-33

[5]高群英，Glover D V玉米籽粒發(fā)育過程中胚乳核DNA含量的變化同籽粒性狀的關(guān)系[J] 作物學(xué)報，1994，20（1）：46-51

[6]高榮歧，董樹亭，胡昌浩，等 玉米盾片發(fā)育過程中超微結(jié)構(gòu)的變化[J]作物學(xué)報， 1997，23（2）：232-235

[7]Doehlert D C， Kuo T M， Felker F C Enzymes of sucrose and hexose metabolism in developing kernels of two inbreds of maize [J] Plant Physiology， 1988， 86（4）：1013-1019

[8]Johningle B D， Hageman R H Changes in composition during development and maturation of maize seeds[J]Plant Physiology， 1997，116：835-839

[9]劉開昌，胡昌浩，董樹亭，等高油、高淀粉玉米籽粒主要品質(zhì)成分積累及其生理生化特性[J]作物學(xué)報，2002，28（4）：492-498

[10]Wardlaw I F The early stages of grain development in wheat： response to water stress in a single variety [J] Austrian Journal of Biological Science， 1971， 24：1047-1055

[11]Ouattar S， Jones K J， Crookston R K Effect of water deficit during grain filling on the pattern of maize kernel growth and development [J] Crop Science， 1987， 27（4）：726-730

[12]Lur H S， Setter T L Endosperm development of maize defective kernel （dek） mutants Auxin and cytokinin levels[J]Ann Bot， 1993a，72：1-6

[13]Lur H S， Setter T L Role of auxin in maize endosperm development （Timing of nuclear DNA endoreduplication， zein expression， and cytokinin）[J]Plant Physiol，1993b，103：273-280

[14]Artlip T S Water deficit in developing endosperm of maize： cell division and nuclear DNA endoreduplication[J]Plant Cell Environ，1995，18：1034-1040

[15]Jones R J， Schreiber B M， Roessler J A Kernel sink capacity in maize： genotypic and maternal regulation[J]Crop Sci，1996，36：301-306

[16]Commuri P D， Jones R LHign temperatures during endosperm cell division in maize： a genotypic comparison under in vitro and field conditions [J] Crop Sci， 2001， 41：1122-1130

[17]Raeker M O， Gaines C S， Finney P L， et al Granule size distribution and chemical composition of starches from 12 soft wheat cultivars [J] Cereal Chem， 1998， 75：721-728

[18]Peng M， Gao M， Abdel-Aal E S M， et al Separation and characterization of A- and B-type starch granules in wheat endosperm [J] Cereal Chem， 1999，76：375-379

[19]Stoddard F L Survey of starch particle-size distribution in wheat and related species[J]Cereal Chem，1999，76：145-149

[20]Sharp R E， Poroyko V， Hejlek L G， et al Root growth maintenance during water deficits：physiology to functional genomics [J]JExpBot，2004， 55：2343–2351

[21]Stinard P S， Robertson D S， Schnable P S Genetic isolation， cloning， and analysis of mutator-induced， dominant antimorph of the maize amylose-extender1 locus[J]Plant Cell，1993，5：1555-1566

[22]關(guān)義新，戴俊英，徐日昌，等玉米花期干旱及復(fù)水對植株補償生長及產(chǎn)量的影響[J]作物學(xué)報，1997，23（6）：740-745

[23]李建生玉米淀粉品質(zhì)遺傳改良研究的進展[J]作物雜志，1998，增刊：114-118