摘要：隨著高通量測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展和測(cè)序成本不斷降低，高通量測(cè)序近幾年在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究領(lǐng)域中得到了充分應(yīng)用，為新品種選育和品質(zhì)改良帶來(lái)了新的科研方法和解決方案，加快了新品種的育種進(jìn)程。高通量測(cè)序技術(shù)的主要應(yīng)用方向包括對(duì)農(nóng)作物和栽培品種進(jìn)行全基因組從頭測(cè)序和深度重測(cè)序、遺傳差異分析、分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)、遺傳連鎖分析、表觀遺傳分析和轉(zhuǎn)錄組分析等。本文系統(tǒng)闡述了近幾年高通量測(cè)序技術(shù)在農(nóng)業(yè)研究中的應(yīng)用進(jìn)展，展示高通量測(cè)序在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：高通量測(cè)序；農(nóng)業(yè)生物技術(shù)；全基因組測(cè)序；重測(cè)序

中圖分類(lèi)號(hào)：Q503文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）01-0137-04

雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)、遺傳密碼的破解、第一個(gè)完整基因組圖譜的繪制完成[1]讓科學(xué)家越來(lái)越認(rèn)識(shí)到測(cè)序在生物學(xué)研究中的重要作用。作為最重要的分子生物學(xué)分析方法之一，DNA測(cè)序不僅為遺傳信息的揭示和基因表達(dá)調(diào)控等基礎(chǔ)生物學(xué)研究提供重要數(shù)據(jù)，而且在基因診斷和基因治療等應(yīng)用研究中也發(fā)揮著重要的作用。

1977年Sanger等發(fā)表了利用末端終止反應(yīng)的DNA測(cè)序方法，使得大規(guī)模、自動(dòng)化的DNA測(cè)序成為可能，并成功地測(cè)定了包括人類(lèi)基因組、水稻基因組等在內(nèi)的若干生物的基因組序列[2]。隨著科學(xué)的發(fā)展，傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序技術(shù)由于成本過(guò)高、通量較低、耗時(shí)耗力等缺點(diǎn)，較大地限制了DNA測(cè)序的應(yīng)用。自2005年以來(lái)，以羅氏公司的454技術(shù)、Illumina公司的Solexa技術(shù)和ABI公司的SOLID技術(shù)為標(biāo)志的高通量技術(shù)相繼誕生。高通量測(cè)序技術(shù)堪稱(chēng)測(cè)序技術(shù)發(fā)展歷程的一個(gè)里程碑，該技術(shù)使得獲得核苷酸序列數(shù)據(jù)的單堿基測(cè)序費(fèi)用相對(duì)于Sanger測(cè)序急劇下降，可以對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè)DNA分子同時(shí)測(cè)序，這使得對(duì)同一物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進(jìn)行細(xì)致全貌的分析成為可能，隨之也給基因組學(xué)研究帶來(lái)了更多的新方法和新方案。目前，高通量測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物全基因組測(cè)序、基因組重測(cè)序、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、小RNAs測(cè)序和表觀基因組測(cè)序等方面。本文對(duì)高通量測(cè)序技術(shù)在農(nóng)業(yè)研究中的一些具體應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

1全基因組重測(cè)序

全基因組重測(cè)序是對(duì)已知基因組序列的物種進(jìn)行不同個(gè)體的基因組測(cè)序，并在此基礎(chǔ)上對(duì)個(gè)體或群體進(jìn)行差異性分析。全基因組重測(cè)序的個(gè)體，通過(guò)序列比對(duì)，可以找到大量的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNP）、插入缺失位點(diǎn)（InDel，Insertion/Deletion）、結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn)（SV，Structure Variation），通過(guò)生物信息學(xué)手段，分析不同個(gè)體基因組間的結(jié)構(gòu)差異，同時(shí)完成注釋。隨著測(cè)序成本的降低及可擁有參考基因組序列物種的增多，基因組重測(cè)序已經(jīng)成為動(dòng)植物育種研究中迅速有效的方法之一，在全基因組水平上進(jìn)行掃描并檢測(cè)與重要性狀相關(guān)的位點(diǎn)，對(duì)育種研究具有重大的科研與產(chǎn)業(yè)價(jià)值。

11利用重測(cè)序進(jìn)行進(jìn)化分析及SNP篩選

Lai 等（2010）[3]對(duì)6個(gè)玉米（Zea mays）骨干自交系進(jìn)行了全基因組重測(cè)序，共發(fā)現(xiàn)1 273 124個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)（SNPs）， 得到30 178個(gè)1～6 bp的插入缺失位點(diǎn)（InDels），新發(fā)現(xiàn)的這些SNPs和InDels提供了1個(gè)高密度的全基因組標(biāo)記信息，同時(shí)也鑒定出數(shù)百個(gè)基因獲得與丟失變異（Presence/Absence Variations， PAVs）。Jiao等（2012）[4]利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)來(lái)自不同區(qū)域以及不同年代的278份玉米自交系基因組進(jìn)行了系統(tǒng)分析，闡述了現(xiàn)代玉米育種過(guò)程中發(fā)生的基因組遺傳變化規(guī)律，平均每個(gè)品系得到了2倍的數(shù)據(jù)，獲得了13萬(wàn)億個(gè)堿基對(duì)和27 818 705個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)的信息量。Huang等（2010）[5]利用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合自主研發(fā)的基因型分析方法，對(duì)517份水稻地方品種資源進(jìn)行了約1倍深度的測(cè)序，獲得了270 Gb數(shù)據(jù)，構(gòu)建了高密度的水稻單體型圖譜（HapMap），鑒定了大約360萬(wàn)個(gè)SNP位點(diǎn)。并利用373個(gè)秈稻品種對(duì)水稻株型、產(chǎn)量、籽粒品質(zhì)和生理特征等14個(gè)農(nóng)藝性狀進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析研究，通過(guò)連鎖分析鑒定的位點(diǎn)可解釋約36%的表型變異。Zheng等（2011）[6]對(duì)3個(gè)高粱（Sorghum bicolor）品系進(jìn)行了全基因組重測(cè)序， 每株測(cè)序深度為12倍， 以已測(cè)的美國(guó)籽實(shí)高粱基因組序列為參考進(jìn)行信息分析，發(fā)掘出1 057 018個(gè)SNPs、 99 948個(gè)1～10 bp長(zhǎng)的InDels、 16 487個(gè)PAVs 和17 111 個(gè)拷貝數(shù)變異。同時(shí)， 在甜高粱和籽實(shí)高粱序列中鑒定出近1 500個(gè)序列結(jié)構(gòu)差異基因，這些基因參與糖與淀粉代謝、木質(zhì)素和香豆素合成、核酸代謝、脅迫應(yīng)答和DNA 修復(fù)等生物學(xué)過(guò)程。

12利用重測(cè)序技術(shù)鑒定突變體突變基因

正向遺傳突變與適應(yīng)性進(jìn)化是創(chuàng)造出帶有希望性狀的新變異有機(jī)體的有力工具和途徑，高通量技術(shù)的出現(xiàn)，使突變體在親本株系擁有參考基因組的情況下，可以快速準(zhǔn)確地獲得這個(gè)突變體的基因組信息，快速完成對(duì)突變位點(diǎn)的定位和鑒定。

Ashelford 等（2011）[7]對(duì)一個(gè)擬南芥突變體ebi-1的回交系進(jìn)行基因組重測(cè)序， 隨后又通過(guò)對(duì)突變體的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行調(diào)查使得候選SNPs數(shù)目得以有效縮小，最終成功鑒定出1個(gè)在AtNFXL-2基因中引起ebi-1突變表型的SNPs 位點(diǎn)。該研究證實(shí)利用回交系材料可以降低遺傳背景噪音， 對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析可有效減少候選SNPs 數(shù)目，利用二代測(cè)序技術(shù)直接對(duì)突變體和野生型測(cè)序成為鑒定突變體突變位點(diǎn)的直接有效的策略。主要的農(nóng)藝性狀是由多基因控制的，單個(gè)基因僅引起較小的表型效應(yīng)，故而對(duì)其鑒定和克隆非常困難。Abe等（2012）[8]利用基因組重測(cè)序技術(shù)分析一個(gè)日本骨干水稻栽培品種Hitomebore的7個(gè)突變體，鑒定出來(lái)包含了淡綠色葉片及半矮生突變表型相關(guān)突變位點(diǎn)的唯一基因組區(qū)域，該突變位點(diǎn)平均初定位區(qū)域?yàn)?1 Mb。結(jié)果顯示，這種基于對(duì)一個(gè)分離群體中呈現(xiàn)有用表型植株的DNA混合后而進(jìn)行的全基因組測(cè)序可以加速水稻及其他作物的遺傳改良。

2全基因組de novo測(cè)序

全基因組de novo測(cè)序也稱(chēng)為從頭測(cè)序，是直接對(duì)某個(gè)物種進(jìn)行基因組全測(cè)序，然后利用生物信息學(xué)方法對(duì)序列進(jìn)行拼接和組裝，得到完整的物種基因組序列?；蚪M測(cè)序?qū)ρ芯课锓N的基因組和功能基因信息、闡明物種的進(jìn)化及其生長(zhǎng)發(fā)育具有重要的意義。植物基因組通常較大且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，利用Sanger測(cè)序來(lái)測(cè)定全基因組序列花費(fèi)巨大且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，大大地限制了基因組信息在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用效率，而高通量測(cè)序以成本低、通量高、快速等特點(diǎn)使物種全基因組測(cè)序成為可能。Huang等（2009）[9]完成的黃瓜（Cucumis sativusL）全基因組測(cè)序是世界上第一個(gè)完成全基因組測(cè)序的蔬菜作物，該工作的完成對(duì)黃瓜及其他近緣物種的遺傳改良、基礎(chǔ)生物學(xué)研究等具有重要的意義。 研究人員利用高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合Sanger方法對(duì)黃瓜進(jìn)行了約72倍深度的測(cè)序，經(jīng)過(guò)拼接與組裝后獲得了2435 Mb的序列，大概覆蓋了黃瓜基因組728%的區(qū)域。熊貓（Ailuropoda melanoleuca）是第一次完全采用高通量測(cè)序技術(shù)完成基因組全測(cè)序的大型物種。蘋(píng)果（Malus domestica Borkh）、金小蜂（Nasonia vitripennis， N giraulti和 N Longicornis）等多個(gè)物種的全基因組測(cè)序都是采用了新一代的測(cè)序技術(shù)。隨著新一代測(cè)序技術(shù)的飛速發(fā)展，基因組測(cè)序所需的成本較傳統(tǒng)技術(shù)大大降低，時(shí)間周期也大大縮短，大規(guī)模地物種全基因組de novo測(cè)序漸入佳境， 基因組學(xué)研究也迎來(lái)新的發(fā)展契機(jī)和革命性突破。

3轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究

轉(zhuǎn)錄組是指特定組織或細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來(lái)的所有RNA的總和，包括mRNA和非編碼RNA。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是指通過(guò)新一代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)cDNA測(cè)序，利用統(tǒng)計(jì)相關(guān)reads數(shù)計(jì)算出不同mRNA的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平的SNP、新的mRNA等，該技術(shù)可以從表達(dá)水平、等位基因特異性表達(dá)、RNA編輯、含有重要信息的融合基因轉(zhuǎn)錄子、差異剪接等方面展開(kāi)相關(guān)研究。Zhang等（2010）[10]用8種不同水稻（Oryza sativa L）樣品的不同組織于不同時(shí)期混合建庫(kù)，通過(guò)轉(zhuǎn)錄組技術(shù)分析了栽培稻的第1張轉(zhuǎn)錄組圖譜，結(jié)果在水稻8種組織樣品中檢測(cè)到大約27 000個(gè)基因的表達(dá)和38 000個(gè)轉(zhuǎn)錄單元，證實(shí)了約9 000個(gè)基因發(fā)生可變剪接，同時(shí)鑒定出了234個(gè)由反式剪接產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄融合基因，表明融合基因比預(yù)期的更為普遍。Wu等（2010）[11]利用采集的接種霜霉病后4～8 d葡萄葉片混合樣，通過(guò)Solexa技術(shù)測(cè)序獲得了15 249個(gè)候選差異表達(dá)基因。這些研究結(jié)果表明，基于高通量測(cè)序的de novo轉(zhuǎn)錄組分析可在非模式動(dòng)植物物種， 特別是在基因組大且復(fù)雜的物種中，可有效地用于新基因的發(fā)現(xiàn)和新分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)。

4外顯子組測(cè)序

外顯子組是指全部外顯子區(qū)域的集合，該區(qū)域包含合成蛋白質(zhì)所需的重要信息，涵蓋了與個(gè)體表型相關(guān)的絕大部分功能性變異，能夠直接發(fā)現(xiàn)與蛋白質(zhì)功能變異相關(guān)的遺傳突變。外顯子組序列捕獲及第二代測(cè)序是一種新型的基因組分析技術(shù)，可以將感興趣的基因組區(qū)域定制成特異性的探針。相比于全基因組重測(cè)序， 外顯子組和目標(biāo)區(qū)域測(cè)序更加經(jīng)濟(jì)高效。 目前， 在醫(yī)學(xué)基因組學(xué)研究領(lǐng)域，外顯子組和目標(biāo)區(qū)域測(cè)序技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到尋找人類(lèi)各種疾病相關(guān)的致病基因和易感基因的研究中；而在動(dòng)植物研究中，已有的報(bào)道主要集中在小鼠（Mus musculu）[12]中， 在大豆（Glycine max）[13，14]、牛（Bos taurus）[15]、果蠅（Drosophila melanogaster）[16]等物種中也有部分報(bào)道。

5小分子RNA測(cè)序

小分子RNA是一類(lèi)長(zhǎng)約20～30個(gè)核苷酸的非編碼RNA分子，其介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控是植物中的一種新型基因調(diào)控機(jī)制。它在植物生長(zhǎng)發(fā)育和適應(yīng)外界各種環(huán)境脅迫的過(guò)程中起著非常重要的作用。植物中小分子RNA數(shù)量巨大、種類(lèi)繁多，而高通量測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)大大加快了它們的發(fā)現(xiàn)過(guò)程。Wei等（2009）[17]對(duì)飛蝗進(jìn)行了小RNAs測(cè)序。通過(guò)與miRBase數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)鑒定出50個(gè)保守的miRNA家族， 并在沒(méi)有飛蝗參考基因組序列的情況下， 通過(guò)生物信息分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)了185個(gè)飛蝗特有的miRNAs家族。Moxon等利用454-FLX 法分析了番茄葉片和果實(shí)中的小分子RNA表達(dá)情況，結(jié)果表明：番茄miR390 和miR1917在果實(shí)中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于在葉片中，而且miR1917的靶基因LeCTR1在番茄成熟過(guò)程中應(yīng)答乙烯時(shí)表達(dá)量顯著下調(diào)，因此認(rèn)為這2個(gè)miRNA 可能參與了番茄果實(shí)的發(fā)育過(guò)程。

新一代測(cè)序技術(shù)的誕生對(duì)分子生物學(xué)的深入研究發(fā)揮了巨大的促進(jìn)作用，以新一代測(cè)序技術(shù)為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和全基因組測(cè)序相比，成本很低，數(shù)據(jù)量大，且不易受遺傳背景限制，可構(gòu)建豐富的表達(dá)基因數(shù)據(jù)庫(kù)，為進(jìn)一步研究提供重要基礎(chǔ)和依據(jù)。除文中所闡述的幾方面的測(cè)序外，還有表觀基因組測(cè)序、降解組測(cè)序等多樣的測(cè)序類(lèi)型，本文中所羅列的試驗(yàn)實(shí)例，僅僅是高通量測(cè)序在農(nóng)業(yè)研究中的部分案例。現(xiàn)在高通量測(cè)序已被廣泛應(yīng)用于以轉(zhuǎn)錄組測(cè)序等為代表的功能基因組學(xué)研究中。隨高通量測(cè)序技術(shù)而出現(xiàn)的數(shù)字基因表達(dá)譜（DGE）測(cè)序、小RNAs 測(cè)序、降解組測(cè)序、DNA甲基化測(cè)序、染色質(zhì)免疫共沉DNA 測(cè)序等新方法為科學(xué)家們進(jìn)行分子生物學(xué)相關(guān)研究提供了更多的選擇。總而言之， 高通量測(cè)序技術(shù)給基因組學(xué)研究帶來(lái)了一個(gè)高效的新平臺(tái)和巨大的發(fā)展機(jī)遇。

盡管高通量測(cè)序技術(shù)有諸多的優(yōu)勢(shì)，但其局限性也不容忽視。海量測(cè)序數(shù)據(jù)的產(chǎn)生及分析給研究者提出了巨大的挑戰(zhàn)，如何充分挖掘隱藏在原始數(shù)據(jù)中的生物學(xué)意義及如何對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類(lèi)、存檔成為一個(gè)亟待解決的課題。高通量測(cè)序技術(shù)不適合小規(guī)模測(cè)序，傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序法無(wú)疑還是最佳的選擇，將與高通量測(cè)序技術(shù)長(zhǎng)期并存，在短期內(nèi)還不會(huì)被淘汰。另外，高通量測(cè)序技術(shù)只是研究的開(kāi)端，現(xiàn)在我們所能解釋的生物學(xué)現(xiàn)象和機(jī)制還很有限，即使獲得了基因組信息，如何去解釋和應(yīng)用它，仍是一個(gè)長(zhǎng)遠(yuǎn)的問(wèn)題。參考文獻(xiàn)：

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