摘要：從羽毛加工廠污泥中分離到一株嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia ）YHYJ-1，對羽毛、羊毛和毛發(fā)底物均具有降解作用。菌株YHYJ-1對不同底物的降解能力存在差異，培養(yǎng)36 h羽毛完全降解，羊毛降解時間是72 h，毛發(fā)則在84 h有部分降解作用。分別以可溶性羽毛角蛋白、羽毛粉和偶氮角蛋白為底物進(jìn)行酶活測定，以最高酶活值設(shè)定為100%，3種底物的相對酶活分別為100%、651%和232%，表明菌株YHYJ-1角蛋白酶的最適底物為可溶性角蛋白。菌株YHYJ-1接種于羽毛粉培養(yǎng)基， 培養(yǎng)20 h后角蛋白酶活性急劇升高，28 h酶活達(dá)最大值，之后快速下降。

關(guān)鍵詞：嗜麥芽窄食單胞菌；羽毛；角蛋白質(zhì)；角蛋白酶

中圖分類號：Q9399文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2013）01-0096-04

角蛋白質(zhì)是廣泛存在于羽毛、毛發(fā)、鱗片、蹄、角等組織中的硬性蛋白，是一類具有巨大潛在應(yīng)用價值的廢棄蛋白質(zhì)資源。角蛋白含有大量高度交聯(lián)的二硫鍵結(jié)構(gòu)，不易被一般的蛋白酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等水解[1]，限制了其應(yīng)用。角蛋白分為α-角蛋白和β-角蛋白兩種。α-角蛋白是毛發(fā)的主要構(gòu)成組分，β-角蛋白多見于羽毛中[2]。角蛋白可被微生物分泌的角蛋白酶降解。不同種類微生物產(chǎn)生的角蛋白酶性能存在差異，特別表現(xiàn)于底物特性不同。角蛋白酶底物特性是研究微生物降解角蛋白質(zhì)降解機(jī)理的基礎(chǔ)。

角蛋白不溶于水及大部分有機(jī)溶劑，其活性測定比一般蛋白酶困難。目前測定角蛋白酶的方法主要有3種，一是直接用角蛋白粉（羽毛粉）作為底物[3]；二是使用經(jīng)過修飾的底物偶氮角蛋白[4]或天青角蛋白[5]；三是以可溶性羽毛角蛋白作為底物[6]。

本實(shí)驗(yàn)室從羽毛加工廠污泥中分離到一株高效降解角蛋白質(zhì)的嗜麥芽窄食單胞菌YHYJ-1，并研究了該菌株YHYJ–1的底物特異性，篩選出了最佳酶活測定方法，測定了菌株產(chǎn)角蛋白酶變化曲線，為深入研究其降解角蛋白質(zhì)的機(jī)理提供了依據(jù)。

1材料與方法

11供試菌株與材料

嗜麥芽窄食單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia） YHYJ-1，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院高新技術(shù)研究中心微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

羽毛及羽毛粉：從肉雞屠宰廠取雞毛，洗滌劑漂洗，自來水沖洗后121℃高壓滅菌25 min，再用蒸餾水充分洗凈，80℃烘干。羽毛球磨粉碎過100目篩即羽毛粉。

羊毛與毛發(fā)：羊毛來自山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院肉羊養(yǎng)殖廠，毛發(fā)來自理發(fā)店。自來水清洗，烘至恒重。

羽毛/羊毛/毛發(fā)培養(yǎng)基（1 000 ml）：NaCl 05 g，MgCl2 01 g，CaCl2 006 g，KH2PO4 07 g，K2HPO4 14 g，羽毛/羊毛/毛發(fā)5 g。

羽毛粉培養(yǎng)基（1 000 ml）：NaCl 05 g，MgCl2 01 g，CaCl2 006 g，KH2PO4 07 g，K2HPO4 14 g，羽毛粉10 g。

12角蛋白酶底物特異性

在羽毛、羊毛和毛發(fā)培養(yǎng)基上接種1%的YHYJ-1菌株培養(yǎng)液，37℃、180 r/min培養(yǎng)，觀察YHYJ-1菌株對3種底物的降解情況。

菌株發(fā)酵液蛋白含量測定：采用Bradford（1976）[7]的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)濃度測定，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。菌株YHYJ-1接種于羽毛、羊毛及毛發(fā)培養(yǎng)基中，每12 h取樣1次，測定蛋白質(zhì)含量。

13角蛋白酶活性測定方法

角蛋白粗酶液的制備：以1%的接種量接種于羽毛粉培養(yǎng)基，37℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。4℃、12 000 r/min離心10 min，上清即為角蛋白粗酶液。

可溶性角蛋白、羽毛粉為底物的酶活測定方法參照Vermelho（2010）[8]的方法并加以改進(jìn)：300 μl酶液加300 μl 06%可溶性角蛋白（羽毛粉）底物，50℃水浴反應(yīng)30 min后加入300 μl 04 mol/L TCA終止反應(yīng)。并以10 000 r/min離心10 min，于280 nm處測定吸光度。空白實(shí)驗(yàn)條件同實(shí)驗(yàn)組，在加角蛋白粗酶液前加300 μl 04 mol/L TCA提前終止反應(yīng)。酶活性單位（U）定義為：混合液反應(yīng)30 min后在280 nm的OD值比對照升高001定義為1 U。

偶氮角蛋白為底物的酶活測定方法參照Lin （1992）[4]的方法。酶活性單位（U）定義為：混合液反應(yīng)30 min后在595 nm的OD值比對照升高001定義為1 U。

可溶性角蛋白的制備參照Wawrzkiewicz（1987）[6]的方法略有改動：剪去羽毛羽軸，加入甲醇∶氯仿（體積比1∶1）中，37℃放置30 min脫脂；脫脂的羽毛放入肥皂水中，42℃浸泡12 h；蒸餾水洗滌羽毛，40℃烘干；稱取5 g烘干的羽毛，加入500 ml二甲基亞砜，100℃回流浸提2 h；加入2倍體積冷的丙酮沉淀角蛋白，-20℃放置24 h；8 000 r/min離心5 min，棄上清；用冷的丙酮洗兩次后用蒸餾水洗兩次；40℃烘干后，研成粉末即為可溶性角蛋白。

14嗜麥芽窄食單胞菌發(fā)酵產(chǎn)酶試驗(yàn)

利用瑞士產(chǎn)KLF2000型全自動發(fā)酵罐研究菌株產(chǎn)酶性能。羽毛粉培養(yǎng)基，裝量26L/37L，接種量1%。培養(yǎng)條件為37℃，980 r/min。每4 h取樣1次，離心后測定發(fā)酵液酶活性，繪制嗜麥芽窄食單胞菌產(chǎn)酶曲線。

2結(jié)果與分析

21角蛋白酶底物特異性

以羽毛、羊毛和毛發(fā)為唯一碳氮源研究嗜麥芽窄食單胞菌YHYJ-1的底物利用特性。結(jié)果表明，YHYJ-1菌株對羽毛的降解最快，培養(yǎng)24 h后除羽軸外全部降解，36 h后包括羽軸在內(nèi)全部降解。菌株對羊毛的降解相對較慢，36 h后羊毛開始斷裂，有明顯降解。72 h后，羊毛全部降解。菌株對毛發(fā)的降解最為緩慢，48 h后始發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基有渾濁現(xiàn)象，84 h后毛發(fā)出現(xiàn)斷裂降解現(xiàn)象，但繼續(xù)培養(yǎng)未發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步降解（圖1）。

22發(fā)酵液蛋白質(zhì)含量

發(fā)酵液可溶性蛋白質(zhì)含量變化反映了菌株對角蛋白質(zhì)的降解情況。結(jié)果表明，各底物處理隨培養(yǎng)時間延長，培養(yǎng)液蛋白質(zhì)含量均呈上升趨勢，但底物間差異明顯。以羽毛為底物培養(yǎng)液蛋白質(zhì)含量12 h內(nèi)快速升高，24 h后進(jìn)入平穩(wěn)期，60 h后蛋白含量呈緩慢下降趨勢。以羊毛為底物時，培養(yǎng)液蛋白質(zhì)含量0～48 h持續(xù)升高，之后進(jìn)入平穩(wěn)期并維持較高含量水平。以毛發(fā)為底物培養(yǎng)液蛋白質(zhì)含量增加緩慢，且水平明顯低于羽毛和毛發(fā)底物處理，說明菌株對毛發(fā)的降解能力相對較弱（圖2）。23酶活測定方法研究

分別以可溶性角蛋白、偶氮角蛋白和羽毛粉為底物，測定培養(yǎng)液角蛋白酶活性，以最高酶活為100%。結(jié)果表明，以可溶性角蛋白為底物酶活最高（100%），其次為羽毛粉底物（為可溶性角蛋白底物的651%），偶氮角蛋白底物的酶活僅為可溶性角蛋白底物的232%。測定過程還發(fā)現(xiàn)，以羽毛粉做底物的測定結(jié)果不穩(wěn)定，不適合作為底物。上述結(jié)果表明，研究嗜麥芽窄食單胞菌YHYJ-1的角蛋白酶特性的最適宜底物為可溶性角蛋白質(zhì)。

24嗜麥芽窄食單胞菌發(fā)酵產(chǎn)酶曲線

以羽毛粉為底物對嗜麥芽窄食單胞菌進(jìn)行發(fā)酵，接種培養(yǎng)20 h后角蛋白酶活性快速升高，28 h達(dá)到最大值，之后急劇下降，48 h后酶活降到很低水平（圖3）。

嗜麥芽窄食假單胞菌屬于革蘭氏陰性原核微生物，大都為條件致病菌，限制了其應(yīng)用?，F(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)注重高效功能基因資源的研究與開發(fā)，近年來已有關(guān)于嗜麥芽窄食假單胞菌產(chǎn)蛋白酶及降解羽毛功能的報道[9～11]。本實(shí)驗(yàn)室分離到一株能在36 h內(nèi)完全降解羽毛的嗜麥芽窄食單胞菌YHYJ-1，其效率遠(yuǎn)高于之前的文獻(xiàn)報道[1，12～14]。研究表明，菌株YHYJ-1對羽毛、羊毛和毛發(fā)底物均具有降解作用，但不同底物間的降解能力存在差異。該菌株能在培養(yǎng)36 h完全降解羽毛，對羊毛的降解時間為72 h，毛發(fā)底物則在84 h有部分降解作用，顯示了其對羽毛角蛋白的高效降解功能。為研究菌株YHYJ-1的角蛋白酶性能，分別以可溶性角蛋白、偶氮角蛋白和羽毛粉為底物測定其活性，從而確定了該菌株產(chǎn)生角蛋白酶的最適底物為可溶性角蛋白 。對菌株YHYJ-1產(chǎn)角蛋白酶變化研究表明，羽毛粉培養(yǎng)基中接種培養(yǎng)28 h角蛋白酶活性達(dá)最高值 ，酶活性隨時間推移，菌株降解羽毛的進(jìn)程加快，發(fā)酵液可溶性蛋白質(zhì)含量增加，且變化趨勢一致 。表明嗜麥芽窄食單胞菌YHYJ-1降解羽毛角蛋白質(zhì)機(jī)理主要是角蛋白酶作用。上述研究結(jié)果對研究嗜麥芽窄食單胞菌YHYJ-1降解角蛋白質(zhì)機(jī)理提供了理論基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)：

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