摘要：從優(yōu)質(zhì)花生魯花14的cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)一條序列，全長為1 399 bp，3′端含有polyA尾，通過blastx搜索得知其為蛋白激酶基因，命名為AhSTK。以該花生cDNA序列為模板設(shè)計(jì)引物，克隆得到花生AhSTK基因。序列分析表明，AhSTK基因的開放閱讀框長度為1 080 bp，編碼359個(gè)氨基酸，預(yù)測其分子量為389 kD，等電點(diǎn)為642，編碼的蛋白質(zhì)無信號肽，無跨膜結(jié)構(gòu)，預(yù)測定位于細(xì)胞質(zhì)。與其他植物中蛋白激酶的氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，與大豆GmSTK蛋白同源性最高。器官特異性分析發(fā)現(xiàn)，該基因在花生根中表達(dá)量較高，而在花中表達(dá)量較低?；ㄉ鶤hSTK基因的克隆為進(jìn)一步研究其生物學(xué)功能和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：花生；蛋白激酶；AhSTK蛋白；序列分析；器官特異性表達(dá)

中圖分類號：Q785文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2013）01-0009-05

蛋白激酶是一類磷酸轉(zhuǎn)移酶，在真核生物中其作用是將ATP的γ磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物特定的氨基酸殘基上，使蛋白質(zhì)磷酸化。目前在很多植物中發(fā)現(xiàn)并分離出了蛋白激酶，如擬南芥[1]、玉米[2]、小麥[3]、豌豆[4]、煙草[5]、紫花苜蓿[6]、大豆[7]、番茄[8]、水稻[9]等，這些蛋白激酶的磷酸化過程被證實(shí)參與植物中的許多信號途徑，包括抵抗高鹽、干旱和低溫等惡劣條件的反應(yīng)，調(diào)節(jié)植物組織、器官的正常發(fā)育，保持植物正常生理功能，參與激素信號傳遞等。

Stone和Walker根據(jù)蛋白激酶催化區(qū)域氨基酸序列的相似性，將植物蛋白激酶分為5大組，分別為①AGC組：以cAMP（環(huán)腺苷酸）依賴的蛋白激酶PKA、cGMP（環(huán)鳥苷酸）依賴的蛋白酶PKG及鈣和磷脂依賴的蛋白激酶PKC為代表，以受第二信使（如cAMP、cGMP、DAG和Ca2+）激活為特征；②CaMK組：包括Ca2+/CaM依賴的蛋白激酶CaMK、Ca2+依賴而CaM不依賴的蛋白激酶CDPK等，依賴第二信使是該組蛋白激酶的普遍性；③CMGC組：包括MAPK（分裂原激活的蛋白激酶）、CDK（周期素依賴的蛋白激酶）等，相對于前2組蛋白激酶依賴于第二信使，該組激酶作用于下游的磷酸化級聯(lián)系統(tǒng)；④傳統(tǒng)的PTK組：為酪氨酸蛋白激酶，目前在植物中尚未發(fā)現(xiàn)純粹的酪氨酸蛋白激酶，但并不意味著Tyr殘基的磷酸化對植物不重要。二重特異性蛋白激酶如MAPKK在植物中的發(fā)現(xiàn)，證明了Tyr殘基的磷酸化可能在高等植物中具有重要的生理作用；⑤其它組：如類受體蛋白激酶RLKs及乙烯信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件CTRl（胞質(zhì)級聯(lián)蛋白激酶MAPKKK）等[10]。一般由蛋白激酶催化的磷酸化反應(yīng)中接受磷酸基的部位是絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸的羥基。蛋白激酶在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中主要有兩個(gè)方面的作用：一是通過磷酸化調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性，磷酸化和去磷酸化是大多數(shù)信號通路組分可逆激活的共同機(jī)制，一些蛋白質(zhì)磷酸化后具有活性，一些則去磷酸化后具有活性；二是通過蛋白質(zhì)的逐級磷酸化，使信號逐級放大，引起細(xì)胞反應(yīng)[11]。

對植物蛋白激酶的研究開始較晚，主要集中在對受體蛋白激酶的研究上，其他類蛋白激酶的研究還處于初級階段。隨著在越來越多植物中發(fā)現(xiàn)蛋白激酶，它在植物生長發(fā)育、抗逆性、激素及鈣信號傳導(dǎo)等的作用研究也越來越深入。這為了解植物生長發(fā)育及抗逆性機(jī)制，改良植物尤其是農(nóng)作物表觀性狀或抗逆性等方面提供了必要的條件[12]。

花生是我國重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物之一，種植面積約5025×104 hm2，總產(chǎn)量居世界首位[13]?；ㄉ谄渖L過程中經(jīng)常會(huì)遭受不同的生物和非生物脅迫，嚴(yán)重影響植物的生長發(fā)育，并對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成極大的負(fù)面影響[14]。通過對花生AhSTK基因及其編碼蛋白的分析與研究，可以了解其參與的信號途徑及其生理功能，為增強(qiáng)花生抗逆性、調(diào)節(jié)花生生長發(fā)育及提高花生產(chǎn)量提供一定的理論基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)從優(yōu)質(zhì)花生魯花14 cDNA文庫中獲得了AhSTK基因， 利用PCR方法獲得AhSTK基因目的片段，對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為今后的轉(zhuǎn)基因工作奠定基礎(chǔ)。1材料與方法

11試驗(yàn)材料

111植物材料試驗(yàn)材料為優(yōu)質(zhì)花生品種魯花14，種植于山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)農(nóng)場。

112試驗(yàn)試劑RNA 的CTAB 提取液由本實(shí)驗(yàn)室配制，參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（Sambrook and Russell， 2002）；DNA回收試劑盒（TIANGEN），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas），rTaq酶（Takara），T4 DNA Ligase（Takara），其他常規(guī)化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

113載體及菌株T3克隆載體、大腸桿菌（Escherichia coil）DH5α均購于全式金。

114引物的合成目的基因的克隆引物和花生內(nèi)參基因Actin的克隆引物（上海生工公司合成）。

12試驗(yàn)方法

121AhSTK基因序列的獲得通過對花生EST序列（EG0288151、ES7036391、ES7037731、ES7229771、GO3267121、GO3322971）進(jìn)行電子拼接得到AhSTK基因序列。

122花生總RNA的提取、純化及反轉(zhuǎn)錄取適量花生根、莖、葉、幼嫩種子、花加入液氮研磨，用CTAB法提取總RNA。按照Fermentas公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到完整的cDNA。所有cDNA樣品均保存于-20℃冰箱中備用。

123目的基因的獲得與克隆以該序列為模板，利用上游引物AhSTK-S和下游引物AhSTK-A克隆該基因。 PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s， 55℃退火30 s，72℃延伸1 min 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用10%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將與目的基因大小一致的PCR產(chǎn)物回收，回收的目的片段連入T3克隆載體測序。

124質(zhì)粒的提取、DNA片段的回收 分別采用TIANGEN公司的普通質(zhì)粒小提試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行。

125目的基因序列分析目的基因序列采用NCBI數(shù)據(jù)庫ORF Finder（http：//wwwncbinlm

nihgov/gorf/gorfhtml） 在線分析獲得開放閱讀框，使用Primer50翻譯獲得氨基酸序列，登陸網(wǎng)站http：//webexpasyorg/protparam/推測目的蛋白的分子質(zhì)量和等電點(diǎn)，信號肽、跨膜區(qū)的預(yù)測分別通過網(wǎng)站http：//wwwcbsdtudk/services/SignalP/ 和http：//wwwcbsdtudk/services/TMHMM/獲得，從http：//wwwncbinlmnihgov/Structure/cdd/wrpsbcgi網(wǎng)站獲得AhSTK蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，亞細(xì)胞定位預(yù)測分析在http：//wwwbioinfotsinghuaeducn/SubLoc/上進(jìn)行。將預(yù)測的AhSTK蛋白序列與GenBank中其他植物的AhSTK蛋白通過DNAMAN進(jìn)行序列比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

126器官特異性表達(dá)分析內(nèi)參基因Actin的擴(kuò)增：以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，利用上游引物Actin-S和下游引物Actin-A克隆Actin基因。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸40 s，28個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用15%瓊脂糖凝膠電泳檢測。通過調(diào)整各模板量，使不同樣品擴(kuò)增的Actin的量一致。

AhSTK基因的擴(kuò)增：以摸索好的cDNA模板量和循環(huán)數(shù)、最佳擴(kuò)增條件來擴(kuò)增單一的目的條帶。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸1 min 40 s，32個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物用10%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2結(jié)果與分析

21AhSTK基因序列的克隆

在對花生cDNA文庫進(jìn)行大規(guī)模測序獲得的序列中，我們發(fā)現(xiàn)一條編碼一種蛋白激酶的序列。在NCBI中進(jìn)行Blast比對，找到6條同源性較高的EST序列（EG0288151、ES7036391、ES7037731、ES7229771、GO3267121、GO3322971）。通過電子拼接，可以把這7條EST序列拼接為一條具有完整讀碼框的花生蛋白激酶基因序列。該序列全長1 399 bp，5′UTR 為52 bp，3′UTR為267 bp，讀碼框1 080 bp（圖1）。

22AhSTK基因序列分析

通過NCBI中的ORF Finder分析知，AhSTK基因具有完整的開放閱讀框（ORF），在擴(kuò)增片段的36 bp處有起始密碼子ATG，在1 113 bp處有終止密碼子TAA（見圖1），因此該基因編碼的蛋白質(zhì)有359個(gè)氨基酸，其相對分子量約為389 kD，等電點(diǎn)為642。

通過NCBI軟件分析該蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)從70到265氨基酸之間含有以cAMP（環(huán)腺苷酸）依賴的蛋白激酶PKA的保守催化結(jié)構(gòu)域（圖3），催化ATP的γ磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物特定的絲氨酸/蘇氨酸或酪氨酸的羥基上，使蛋白質(zhì)磷酸化，引起下一個(gè)激酶的反應(yīng)，以此使信號從細(xì)胞表面?zhèn)鬟f到靶蛋白，引起細(xì)胞反應(yīng)。

根據(jù)http：//prositeexpasyorg/分析保守結(jié)構(gòu)域，67到347氨基酸之間是蛋白激酶的結(jié)構(gòu)域，從81處的纈氨酸到96處的賴氨酸之間是ATP結(jié)合域，193處的異亮氨酸到205處的異亮氨酸之間是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性域。

根據(jù)以上分析推測，AhSTK基因編碼的蛋白催化ATP的γ磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到底物特定的絲氨酸/蘇氨酸羥基上，屬于PKA。如多數(shù)蛋白激酶一樣，此類蛋白激酶自身受到嚴(yán)格的調(diào)節(jié)，當(dāng)cAMP不存在時(shí)呈非活性形式，與其它蛋白激酶不同的是，活化配體cAMP結(jié)合到特異的調(diào)節(jié)亞基（R）上引起構(gòu)型的改變從而導(dǎo)致全酶的解離，經(jīng)活化而解離的催化亞基（C）和所有真核生物的蛋白激酶有著廣泛相似的結(jié)構(gòu)序列。

23AhSTK蛋白的信號肽與亞細(xì)胞定位分析

經(jīng)過SignalP40軟件分析，發(fā)現(xiàn)AhSTK蛋白沒有信號肽；用TMHMM20分析得知，該蛋白不含跨膜結(jié)構(gòu)域；亞細(xì)胞定位分析顯示該蛋白位于細(xì)胞質(zhì)。

24AhSTK蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

利用DNAMAN軟件將該基因氨基酸序列與其他六種植物氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)有很高的同源性，其中與大豆中的GmSTK蛋白同源性最高，其次是苜蓿（圖4）。

25AhSTK的器官特異性表達(dá)分析

我們進(jìn)一步分析了AhSTK基因在花生不同器官的表達(dá)情況，結(jié)果（圖5）表明，AhSTK基因在根中表達(dá)量最高，在幼嫩種子中次之，花中表達(dá)量最低。

本研究從花生中克隆并鑒定了AhSTK基因。用NCBI中的ORF Finder找出該基因具有完整的開放ORF，編碼359個(gè)氨基酸，從70到265氨基酸之間含有蛋白激酶保守的催化結(jié)構(gòu)域，從81處的纈氨酸到96處的賴氨酸之間是ATP結(jié)合域，193處的異亮氨酸到205處的異亮氨酸之間是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性域，屬于cAMP（環(huán)腺苷酸）依賴的蛋白激酶PKA。同源性比對發(fā)現(xiàn)與其他植物中的蛋白激酶有很高的同源性，挑選相似性較高的序列進(jìn)行多序列比對，發(fā)現(xiàn)這些蛋白在蛋白激酶保守結(jié)構(gòu)域處序列非常相似；系統(tǒng)進(jìn)化分析得知花生AhSTK蛋白與大豆GmSTK親緣關(guān)系較近，其次是苜蓿。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示其定位在細(xì)胞質(zhì)；半定量分析得出其在根中表達(dá)量最高。這類蛋白在植物中調(diào)節(jié)離子通道活性的功能研究得較清楚，但其參與調(diào)節(jié)基因的表達(dá)及響應(yīng)外界高鹽、干旱等刺激還有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)只對花生中AhSTK基因及其蛋白序列做了克隆與分析，對其功能的研究還需進(jìn)一步探索。參考文獻(xiàn)：

[1]Ferreira P C， Hemerly A S， Villarroel R， et al The Arabidopsis functional homolog of P34cdc2 protein kinase[J] Plant Cell， 1991， 3（5）：531-540

[2]Walker J C， Zhang R Relationship of a putative receptor protein kinase from maize to the S-locus glycoprotein of Brassica[J] Nature， 1990， 345： 743-746

[3]Anderberg R J， Walker-Simmons M K Isolation of a wheat cDNA clone for an abscisic acid-inducible transcript with homology to protein kinases[J] Proc Natl Acad Sci， 1992， 89（21）： 10183-10187

[4]Lin X， Feng X H， Watson J C Differential accumulation of transcripts encoding protein kinase homologs in greening pea seedlings[J] Proc Natl Acad Sci， 1991， 88（16）：6951-6955

[5]Ito Y， Banno H， Moribe T， et al NPK15， a tobacco protein-serine/threonine kinase with a single hydrophobic region near the amino-terminus[J] Mo1 Gen Genet， 1994， 245（1）： 1-10

[6]Pay A， Jonak C， Bogre L， et al The MsK family of alfalfa protein kinase genes encodes homologues of shaggy/glycogen synthase kinase-3 and shows differential expression patterns in plant organs and development[J] Plant Journal， 1993， 3（6）： 847-856

[7]Zhang C， Zhao H， Liu Y， et al Isolation and characterization of a novel glycogen synthase kinase gene， GmGSK， in Glycine max L that enhances abiotic stress tolerance in Saccbaromyces cerevisiae[J] Bio-technology Letters， 2010， 32（6）： 861-866

[8]Martin G B， Brommonschenkel S H， Chunwongse J， et al Map-based cloning of a protein kinase gene conferring disease resistance in tomato[J] Science， 1993， 262（5138）： 1432-1436

[9]董海濤，吳玉良，程志強(qiáng)，等.差異顯示法克隆水稻抗白葉枯病相關(guān)蛋白激酶基因[J].浙江大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，24（5）：548-552.

[10]Stone J M， Walker J C Plant protein kinase families and signal transduction[J] Plant Physiol， 1995， 108（2）：451-457

[11]Garrett R H，Grisham C M.生物化學(xué)（影印版）第3版[M] 北京：高等教育出版社，2005

[12]張春寶，趙麗梅，趙洪錕，等 植物蛋白激酶研究進(jìn)展[J]生物技術(shù)通報(bào)，2011，10：17-23

[13]萬書波花生品質(zhì)學(xué)[M]北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2005，2-10

[14]邵鳳霞花生NAC轉(zhuǎn)錄因子的克隆和功能分析[D]濟(jì)南：山東師范大學(xué)，2009