摘要：渦蟲具有極強的再生能力，并且認為渦蟲體內(nèi)存在一類具有增殖分化潛能被稱為neoblasts的全能干細胞。這種細胞在渦蟲體內(nèi)可發(fā)生遷移、增殖和分化，對其個體組織器官損傷的修復具有重要作用。本實驗中，三角渦蟲經(jīng)過饑餓處理后切取特定的組織塊，然后再經(jīng)過處理使組織塊中的細胞分離出來。分離的細胞繼續(xù)培養(yǎng)并通過堿性磷酸酶檢測最終鑒定為neoblasts干細胞。

關鍵詞：三角渦蟲；全能干細胞；分離；培養(yǎng)；鑒定

中圖分類號：Q959.151+.302文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2013）02-0034-04

渦蟲（Planarian）是動物界最早出現(xiàn)兩側(cè)對稱、三胚層、營自由生活的扁形動物，也是由水生向陸生過渡的重要類群，因而在動物系統(tǒng)演化中占有重要地位[1]。渦蟲國內(nèi)分布廣泛，進化地位十分重要，是發(fā)育生物學、細胞遺傳學和再生生物學、進化和遺傳學研究的好材料。Kawakatsu認為中國的淡水三角渦蟲全部屬于三角渦蟲屬中的日本三角渦蟲（Dugesia japonica Ichikawa et Kawakatsu）[2]。不同的地區(qū)和環(huán)境對其生殖具有一定影響，但大多以有性和無性方式交替進行。渦蟲具有極強的再生能力，已知如果把渦蟲切割成許多小的片段，一周內(nèi)它可以重新長成完整的個體[3，4]。其再生潛能歸因于體內(nèi)一類稱為“neoblasts”的細胞群，這是成體渦蟲體內(nèi)僅有的一類具有增殖分化潛能的干細胞，即成體未分化細胞[5～7]。它在整個個體的間質(zhì)細胞內(nèi)都有分布，而在其它類型細胞如上皮細胞、腸細胞、腦部分布較少；在生長、喂養(yǎng)、饑餓狀態(tài)下細胞狀態(tài)也處于動態(tài)的變化[8～9]。其體內(nèi)neoblasts約占全部細胞的30%，是一種全能干細胞，可分化為體內(nèi)的40多種細胞，因此成為研究胚胎發(fā)育、細胞分化與去分化分子機理的理想材料[10]。

迄今為止，體外分離干細胞技術已有很多報道，建立在對細胞表面標記物的識別基礎上用來純化干細胞的標記包括CD34、AC133、STRO-1、神經(jīng)營養(yǎng)受體p7520等[11]。分離方法包括熒光標記細胞分選、免疫磁分離和免疫吸附柱分離；密度梯度離心法從單個核細胞中分離干細胞也用于渦蟲干細胞的分離[12～13]，但這種方法要求的實驗器材與熟練程度都比較高且操作繁瑣，因此不常用。常用的分離哺乳動物干細胞的方法是通過胰酶處理組織塊，使之消化成單個細胞，再用培養(yǎng)液培養(yǎng)，但處理時會對細胞造成一定程度的損傷。在現(xiàn)代再生科學方面，最早嘗試培養(yǎng)渦蟲細胞是在芝加哥Ch.M.Child’s實驗室[14]。但是直到目前，沒有任何關于穩(wěn)定培養(yǎng)扁形動物細胞系的報道。最近有neoblasts細胞重要性及其分子相關實驗方面的報道，所以在借鑒國外分離日本三角渦蟲全能干細胞neoblasts方法的基礎上，摸索建立穩(wěn)定的neoblasts細胞系非常重要[15～17]。

干細胞的細胞質(zhì)中含有較高的堿性磷酸酶（ALP），而已分化的細胞中活性明顯降低。在堿性磷酸酯酶的催化下，5-溴-4-氯-3吲哚磷酸（BCIP）會被水解產(chǎn)生強反應性的產(chǎn)物，該產(chǎn)物會和氯化硝基四氮唑藍（NBT）發(fā)生反應，形成不溶性的深藍色至藍紫色的NBT-formazan產(chǎn)物，所以利用這一點可以鑒定細胞是否為干細胞[18～19]。本實驗初步摸索了一種分離培養(yǎng)及鑒定渦蟲全能干細胞neoblasts的方法，為下一步開展渦蟲相關方面的研究提供了一定的基礎。