摘要：構(gòu)建pcDNA3.1-hTERT、pcDNA3.1-SV40 T載體，線性化后，共轉(zhuǎn)染荷斯坦奶牛乳腺上皮細(xì)胞，研究人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）和猿猴病毒40大T抗原（SV40 T）對荷斯坦奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的作用，并對細(xì)胞進(jìn)行RT-PCR檢測分析及免疫熒光鑒定。結(jié)果表明， hTERT和SV40 T在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)可以有效地延長細(xì)胞的體外培養(yǎng)時間，增加細(xì)胞傳代次數(shù)，獲得的細(xì)胞系可以正常表達(dá)角蛋白。說明在體外培養(yǎng)的乳腺細(xì)胞中共表達(dá)hTERT和SV40 T可以有效延長細(xì)胞壽命且不影響乳腺細(xì)胞特性。

關(guān)鍵詞：荷斯坦奶牛乳腺上皮細(xì)胞；永生化；端粒酶；猿猴空泡病毒40大T抗原

中圖分類號：Q786文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2013）02-0001-04

乳腺上皮細(xì)胞具有合成和分泌乳汁的功能，在體外培養(yǎng)條件下仍可保持其特性，該特性在制備動物乳腺生物反應(yīng)器及研究外源基因在細(xì)胞水平的表達(dá)具有重要意義[1～3]。另外，利用乳腺上皮細(xì)胞的模型，還可以在體外研究某些激素、因子等對乳腺上皮細(xì)胞的影響，分析乳腺分泌的活性物質(zhì)與乳腺疾病發(fā)生之間的關(guān)系，同時也可以用于乳腺發(fā)育調(diào)控的研究[4]。但是，乳腺上皮細(xì)胞在體外傳代次數(shù)有限，且細(xì)胞活性與體外培養(yǎng)時間呈負(fù)相關(guān)，通過正常培養(yǎng)的手段獲得可以用于體外研究的乳腺上皮細(xì)胞具有很大的難度，正常體外研究中缺少乳腺細(xì)胞模型，這嚴(yán)重制約了外源基因在細(xì)胞水平表達(dá)的研究。因此，通過一些方法延長乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)時間，甚至得到永生化的乳腺上皮細(xì)胞是非常有意義的。

人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）在激活端粒酶的過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中，可以有效激活端粒酶，活化的端粒酶再以其自身為模板不斷合成端粒DNA來補充和延長端粒的長度，有效維持端?？s短和延長的動態(tài)平衡，恢復(fù)染色體的穩(wěn)定性，使細(xì)胞得以逾越M1和M2期，獲得無限分裂和增殖的能力，進(jìn)而延長細(xì)胞體外培養(yǎng)時間或者永生化，同時hTERT的表達(dá)又不會使細(xì)胞的生物學(xué)特征發(fā)生改變，因此受到了越來越多的關(guān)注[5～9]。SV40 T雖然是一種病毒蛋白，但其在端粒酶的活化、生長抑制因子的失活等多方面亦發(fā)揮著積極的作用[10～13]。

本研究以荷斯坦奶牛乳腺細(xì)胞為材料，以真核表達(dá)載體pcDNA3.1（+）為骨架，構(gòu)建表達(dá)載體pcDNA3.1-hTERT和pcDNA3.1-SV40 T，線性化后電轉(zhuǎn)染乳腺上皮細(xì)胞，以期獲得體外永生化的乳腺上皮細(xì)胞系，為在乳腺細(xì)胞水平上研究外源基因的分泌及基因功能研究奠定基礎(chǔ)。