摘要：牛病毒性腹瀉病毒是牛病毒性腹瀉-黏膜病的重要病原體，該病毒病是極為復(fù)雜、呈多臨床類型表現(xiàn)的傳染病，給世界養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究從疑似牛病毒性腹瀉-黏膜病的糞便中分離得到一株病毒能使MDBK細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞病變，經(jīng)RT-PCR檢測(cè)及擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序進(jìn)一步證實(shí)，該病毒為牛病毒性腹瀉-黏膜病病毒，TCID50測(cè)定該病毒的滴度為107.15TCID50/ml。該病毒株的分離鑒定為牛病毒性腹瀉病毒疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：牛病毒性腹瀉-粘膜病病毒；分離；鑒定

中圖分類號(hào)：S852.65+3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）02-0041-04

牛病毒性腹瀉-黏膜病 （Bovine Viral Diarrhea-Mucosal Disease，BVD-MD） 是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine Viral Diarrhea virus，BVDV）感染而引起的一種重要傳染病，臨床上以發(fā)熱、腹瀉、黏膜糜爛、潰瘍、白細(xì)胞減少、持續(xù)感染與免疫耐受、免疫抑制、懷孕母牛流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和畸型胎以及致死性黏膜病為主要特征[1，2]。該病呈世界性分布，廣泛存在于美國、澳大利亞、英國、新西蘭、匈牙利、加拿大、阿根廷、日本、印度等國家[3]。BVDV不僅可感染牛，也能感染綿羊、山羊、豬、鹿和其它反芻動(dòng)物。1946年美國人Olafson等首次發(fā)現(xiàn)并分離出BVDV，1983年我國李佑民等首次從流產(chǎn)胎兒的脾臟中分離到BVDV。BVDV屬于黃病毒科（Flaviviridae），瘟病毒屬（Pestivirus），與豬瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）和綿羊邊界病毒（Border Disease Virus，BDV） 同屬，存在抗原相關(guān)性，在血清學(xué)上存在著交叉反應(yīng)，而且能夠突破宿主特異性發(fā)生交叉感染[4]。根據(jù)BVDV病毒基因組5′端非翻譯區(qū)（5′NTR）序列比較，把BVDV分為牛病毒性腹瀉病毒Ⅰ型（BVDV-Ⅰ）和牛病毒性腹瀉病毒Ⅱ型（BVDV-Ⅱ）[5，6]。根據(jù)BVDV可否使體外培養(yǎng)的傳代上皮細(xì)胞發(fā)生病變效應(yīng)，可分為兩個(gè)生物型（biotype）：致細(xì)胞病變型（cytopathic，CP）和非致細(xì)胞病變型（noncytopathic，NCP）[7]。兩種生物型的病毒雖然與宿主細(xì)胞的作用不同，但BVDV只有一種血清型。BVDV感染情況復(fù)雜，持續(xù)性感染個(gè)體癥狀隱蔽。動(dòng)物帶毒率高，特別是BVDV嚴(yán)重影響感染動(dòng)物的繁殖，因此給全球畜牧業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8]。因而被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為發(fā)病必須上報(bào)的動(dòng)物傳染病之一。本研究采集山東省某牛場(chǎng)發(fā)生嚴(yán)重腹瀉癥狀的病牛的糞便，并對(duì)其進(jìn)行了分離和鑒定，BVDV山東株的獲得為BVDV疫苗的研究奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

牛腎細(xì)胞（MDBK ）由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院奶牛研究中心實(shí)驗(yàn)室保存；DNA Marker DL2000 購于上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基、新生馬血清、胰蛋白酶為HyClone公司生產(chǎn)；MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit，TaKaRa pimeScriptTM RT-PCR Kit，LA Taq酶，dNTP， RNA酶抑制劑，均購于寶生物工程（大連） 有限公司。病料樣品為山東省某牛場(chǎng)發(fā)生嚴(yán)重腹瀉癥狀的病牛的糞便。

1.2病毒培養(yǎng)

1.2.1病料的處理取腹瀉奶牛糞便，用PBS（含10% 雙抗） 1∶5 稀釋。3 000 r/min 離心10 min，得到的上清液經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾除菌后得到病料處理液。

1.2.2病毒的接種選擇生長旺盛的MDBK單層細(xì)胞，棄去營養(yǎng)液。按細(xì)胞培養(yǎng)瓶1%的量接種病料處理液后37℃感作1 h，棄去感作液，加入維持液（2%新生馬血清的DMEM）于5%CO2、37℃培養(yǎng)。12 h觀察細(xì)胞病變，培養(yǎng)24 h后收毒。細(xì)胞毒反復(fù)凍融3次后再次接種MDBK 細(xì)胞，如此傳3代，收獲的細(xì)胞毒用于其它試驗(yàn)。

1.3RT-PCR 鑒定及序列測(cè)定分析

1.3.1引物的設(shè)計(jì)合成根據(jù)已發(fā)表的BVDV NADL 株、Osloss 株、Orengon C24 等毒株的全序列的5′UTR保守區(qū)設(shè)計(jì)BVDV檢測(cè)引物及分型引物[9，10]，引物序列信息見表1，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。稀釋成20 μmol/L，-20℃保存。