摘要：以無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液灌洗奶牛腹腔，分離獲取奶牛腹腔巨噬細(xì)胞，在含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)。采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并通過瑞氏染色計(jì)算其純度。結(jié)果表明，采用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液灌洗奶牛腹腔，能夠獲得較高純度的巨噬細(xì)胞，能為奶牛胞內(nèi)寄生菌存活機(jī)制的研究提供很好的試驗(yàn)材料。

關(guān)鍵詞：奶牛；巨噬細(xì)胞；分離培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S823.9+1；Q813文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2013）02-0038-03

巨噬細(xì)胞（Macrophage）為免疫活性細(xì)胞，是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞，在機(jī)體固有和適應(yīng)性免疫功能中扮演著極其重要的角色，可作為抗原呈遞細(xì)胞在誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其產(chǎn)生的可溶性細(xì)胞活素類因子參與調(diào)節(jié)特異性免疫反應(yīng)。巨噬細(xì)胞也是各類病原的靶細(xì)胞[1]，包括分支桿菌、沙門氏菌、衣原體等。

腹腔巨噬細(xì)胞是腹腔抗感染的第一道防線，是研究機(jī)體自然免疫和獲得性免疫關(guān)系的重要研究材料。但是迄今為止的報(bào)道多為有關(guān)小動(dòng)物如大鼠、豚鼠、小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞的分離鑒定，綿羊[2]、豬[3]、牛[4]等大家畜也有肺泡巨噬細(xì)胞分離的報(bào)道，尚未見有關(guān)奶牛腹腔巨噬細(xì)胞分離鑒定的方法。因此，本研究擬運(yùn)用RPMI-1640培養(yǎng)液灌洗奶牛腹腔的方法，獲得高純度、高活性的腹腔巨噬細(xì)胞并進(jìn)行相關(guān)鑒定，為下一步構(gòu)建奶牛巨噬細(xì)胞噬菌體文庫和以巨噬細(xì)胞為模型研究奶牛免疫機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1主要試劑和儀器

RPMI-1640培養(yǎng)基購自Hyclone，小牛血清購自天津?yàn)笊锕こ坦?，酸性磷酸酶染液、?醋酸萘酚酯酶染液，HE染液試劑盒購自南京建成科技有限公司，瑞氏-姬姆薩染色液購自濟(jì)南百博生物技術(shù)有限公司；儀器主要有CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡。

1.2奶牛腹腔巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)

購15日齡雄性奶牛1只，平躺保定，腹腔注射不含小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液500 ml，輕柔奶牛腹部3～5 min，靜置7～10 min后，用50 ml注射器抽取腹腔液。離心5 min（1 000 r/min），棄上清，用PBS洗滌3遍，再用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度至2×106個(gè)/ml，接種于培養(yǎng)瓶及6孔培養(yǎng)板，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，棄上清液，用不含小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液漂洗2遍，然后加入含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，并作相關(guān)染色和鑒定。

1.3培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

體外培養(yǎng)6 h后，將培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察貼壁細(xì)胞形態(tài)；取已鋪滿細(xì)胞的爬片，晾干后進(jìn)行姬姆薩染色，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.4奶牛腹腔巨噬細(xì)胞HE染色

取出細(xì)胞爬片，固定晾干，按照說明進(jìn)行染色。

1.5奶牛腹腔巨噬細(xì)胞酶化學(xué)測(cè)定

1.5.1酸性磷酸酶染色（CACP） 取出細(xì)胞爬片，固定，晾干，按照說明進(jìn)行染色。每片計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，共觀察5片，計(jì)算陽性率（胞漿內(nèi)有棕紅色顆粒沉淀物為陽性，胞漿內(nèi)粉紅色為陰性）。

1.5.2非特異性酯酶染色 取出細(xì)胞爬片，固定，晾干，放入含10%α-醋酸萘酯的基質(zhì)液（pH=6.3）中孵育1 h，流水沖洗3 min，晾干。甲基綠復(fù)染3 min，流水沖洗，晾干鏡檢。每片計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，共觀察5片，并計(jì)算陽性率（胞質(zhì)內(nèi)有灰黑色沉淀物為陽性，胞質(zhì)內(nèi)無沉淀物為陰性。2結(jié)果與分析

2.1奶牛巨噬細(xì)胞培養(yǎng)及形態(tài)特性