摘要：根據(jù)禽流感病毒的基質(zhì)蛋白（M）基因序列和H5亞型禽流感病毒血凝素（HA）基因、神經(jīng)氨酸酶（NA）基因設(shè)計(jì)并合成了三對(duì)特異性引物，用于建立H5N1禽流感病毒核酸的RT-PCR分型鑒定方法。試驗(yàn)證明，建立的多重PCR方法可以將H5N1與H6N2、H9N2有效區(qū)分。該方法具有較好的靈敏度和特異性，適合在基層動(dòng)物防疫和監(jiān)督部門進(jìn)行H5N1禽流感病毒核酸的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：禽流感病毒；H5N1；多重RT-PCR；檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S854.43 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2013）04-0005-03

高致病性禽流感是一種嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展的烈性傳染病，被OIE列為必須通報(bào)的傳染病[1]。禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）屬于正粘病毒科A型流感病毒屬，AIV除了可感染禽類外，部分亞型還可感染人、豬、馬等。AIV基因組由包括基質(zhì)蛋白（M）基因、血凝素（HA）基因和神經(jīng)氨酸酶（NA）基因在內(nèi)的8個(gè)負(fù)鏈單股RNA片斷組成，其中M基因組序列高度保守，HA基因組變異性最強(qiáng)，NA基因組變異次之。HA基因和NA基因某些位點(diǎn)的變異可導(dǎo)致不同的HA亞型和NA亞型[1]，目前發(fā)現(xiàn)AIV有16個(gè)HA亞型和10個(gè)NA亞型，其中H5、H7亞型常表現(xiàn)為高致病性，除了給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失外[2]，還可感染人，甚至導(dǎo)致死亡[3]。目前，病毒分離、血清學(xué)試驗(yàn)仍是診斷AI和對(duì)AIV進(jìn)行定型普遍采用的方法，但病毒分離不僅操作繁瑣、復(fù)雜和耗時(shí)，難以對(duì)AI進(jìn)行快速診斷，還存在潛在散毒的危險(xiǎn)。PCR方法是一種基因體外擴(kuò)增技術(shù)，可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)對(duì)某片斷基因擴(kuò)大數(shù)百萬(wàn)倍。該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、敏感性高、檢測(cè)快速等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。多重分型PCR是一種特殊PCR形式，其最突出的特點(diǎn)是一次反應(yīng)可以達(dá)到既分型又能夠鑒定亞型的目的，在A、B、C三種流感及其他病源混合感染的鑒別診斷上具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)和很高的實(shí)用價(jià)值[4，5]。根據(jù)RT-PCR技術(shù)的原理，研究建立了鑒定H5、N1、M1的多重RT-PCR分型技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用材料

AIV H5N1抗原，購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；AIV H6N2、H9N2病毒以及新城疫病毒Lasota疫苗株（NDV）、雞減蛋綜合征病毒（EDSV）和傳染性支氣管炎病毒（IBV），本室留存。

1.2 生化試劑

Ex-Taq E、dNTP （25 mol/L，內(nèi)含Mg2+）、RNA酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄酶AMV、10×PCR buffer以及 DNA Marker DL2000 均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；RNA提取液購(gòu)自科登生物工程有限公司；0.1% DEPC水由本室自制；二甲基亞砜購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

參考基因庫(kù)中禽流感病毒M基因、HA基因和NA基因序列，經(jīng)Clustalx序列軟件比對(duì)后，選擇在保守區(qū)域用Primer Primer5.0軟件設(shè)計(jì)了3對(duì)引物（表1）上述引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 病毒RNA的提取

（1）1.5 mL離心管中加入120 μL RNA提取液和120 μL樣品，混勻，室溫放置5 min。

（2）加入120 μL -20℃預(yù)冷的氯仿，混勻，室溫放置3 min。

（3）12 000 r/min， 4 ℃離心5 min，取上清120 μL于另一離心管中，加120 μL -20℃預(yù)冷異丙醇，室溫放置5 min。

（4）12 000 r/min， 4 ℃離心10 min，棄上清，加入600 μL -20 ℃預(yù)冷75%乙醇，上下顛倒，12 000 r/min， 4 ℃離心5 min，棄上清。室溫放置約3 min近干燥。

（5）加20 μL 0.1% DEPC處理過(guò)的水溶解沉淀RNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5多重RT-PCR

采用總體積為50 μL的多重PCR反應(yīng)體系，即10×PCR buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP混合液5 μL，40 U/μL的Rnase Inhibitor 1 μL，5 U/μL的Taq E 1 μL，反轉(zhuǎn)錄酶（AMV）1 μL，二甲基亞砜3 μL，10 pM/μL的 M1、N1、H5基因的上下游引物各0.5 μL，提取的病毒RNA模板1 μL，最后加0.1% DEPC處理過(guò)的水補(bǔ)足至50 μL。振蕩離心混勻后，在PCR儀上設(shè)定程序進(jìn)行擴(kuò)增，通過(guò)對(duì)反轉(zhuǎn)錄條件及多重PCR變性、退火、延伸的溫度和時(shí)間以及循環(huán)次數(shù)等的優(yōu)化，最終確定其反應(yīng)參數(shù)為50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min，94 ℃預(yù)變性2 min后，進(jìn)入94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共循環(huán)35次，然后72 ℃延伸8 min，于12 ℃結(jié)束多重PCR擴(kuò)增。

1.6 PCR產(chǎn)物分析

取7 μL多重PCR產(chǎn)物與2 μL Loading Buffer上樣緩沖液混合，在1.5%瓊脂糖凝膠上以100 V電壓進(jìn)行電泳28 min，然后置數(shù)碼凝膠系統(tǒng)觀察拍照，分析記錄結(jié)果。

回收、純化229、380、878 bp的cDNA擴(kuò)增片段，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，并用DNAStar基因分析軟件分析測(cè)序結(jié)果。

1.7 H5N1多重RT-PCR 敏感性試驗(yàn)

用建立的多重RT-PCR 反應(yīng)體系對(duì)10倍系列稀釋的禽流感H5N1抗原進(jìn)行檢測(cè)，檢驗(yàn)該體系對(duì)各稀釋度抗原模板的敏感度。

1.8 委托樣本的檢測(cè)

用建立的多重RT-PCR 反應(yīng)體系對(duì)5份已知AIV H9樣本、1份已知AIV H6樣本和360份禽咽肛拭子盲樣進(jìn)行檢測(cè)，與出口檢疫正式采用的熒光RT-PCR檢測(cè)方法比較。

2 結(jié)果

2.1 多重RT-PCR特異性試驗(yàn)

經(jīng)多重RT-PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)比較，顯示H5N1抗原擴(kuò)增出380、878、229 bp3條帶，而H6N2、H9N2病毒僅擴(kuò)增出M1cDNA1條帶，NDV、IBV、EDSV則無(wú)條帶呈陰性，與理論預(yù)期值一致（圖1）。

2.2H5N1多重RT-PCR敏感性試驗(yàn)

對(duì)禽流感H5抗原做HA試驗(yàn)，病毒滴度為1：256?？乖謩e做10倍系列稀釋，10-1、10-2、10-3倍抗原稀釋液多重RT-PCR檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性；抗原做10-4及以上倍數(shù)稀釋，多重RT-PCR檢測(cè)結(jié)果陰性。敏感度試驗(yàn)表明，多重RT-PCR 對(duì)抗原的最低檢測(cè)稀釋度為10-3，是一種較為靈敏的檢測(cè)方法（圖2）。

2.3 委托樣本的檢測(cè)

5份已知AIV H9樣本、1份已知AIV H6樣本檢測(cè)結(jié)果顯示，僅擴(kuò)增出229 bp M1cDNA1條帶，360份禽咽肛拭子樣本則無(wú)條帶呈陰性，與熒光RT-PCR 方法檢測(cè)結(jié)果一致，符合率達(dá)100%，說(shuō)明該多重RT-PCR方法可以用于基層動(dòng)物防疫和監(jiān)督部門的檢測(cè)。

3 討論

AIV H5亞型不僅感染家禽，引起大批死亡，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還可感染其他動(dòng)物和人，有重要的公共衛(wèi)生意義。傳統(tǒng)的病毒分離和血清學(xué)試驗(yàn)無(wú)法對(duì)流行的AIV亞型進(jìn)行快速檢測(cè)鑒別。本試驗(yàn)根據(jù)AIV 基因易變異的特性及多重分型PCR引物設(shè)計(jì)原則，參考基因庫(kù)中AIV HA基因、NA基因和M基因序列，分別針對(duì)H5、N1和M1基因設(shè)計(jì)了3對(duì)特異性引物，其中M1（S，A）是A型流感的通用引物。而H5、N1為分別針對(duì)H5、N1亞型的特異性引物，能夠分別特異性地檢測(cè)相對(duì)應(yīng)的亞型。利用這3對(duì)引物，通過(guò)對(duì)多重RT-PCR擴(kuò)增條件的優(yōu)化，建立了快速檢測(cè)鑒定AIV H5亞型的多重RT-PCR分型技術(shù)。

該多重RT-PCR分型方法檢測(cè)結(jié)果顯示，AIV H5N1在380、878、229 bp位置同時(shí)出現(xiàn)3條cDNA擴(kuò)增帶，而H6N2、H9N2病毒僅擴(kuò)增出M1 cDNA 1條帶，傳染性支氣管炎病毒、新城疫Lasota疫苗株（NDV）和減蛋綜合征病毒則呈陰性。多重RT-PCR 敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，H5N1抗原最低檢測(cè)稀釋度為10-3。H5亞型特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，僅H5呈陽(yáng)性，其他H6、H9亞型和NDV、IBV、EDSV均呈陰性。對(duì)所擴(kuò)增片段進(jìn)行回收、純化并測(cè)序，其測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAStar基因分析軟件分析，這些片段分別與AIV HA基因、NA基因和M基因有著高度同源性，提示這些擴(kuò)增基因的序列與原參考序列的基因來(lái)源一致，即分別來(lái)源于AIV的H5亞型HA基因、NA基因和M基因，表明該多重RT-PCR分型方法具有高度特異性。

同時(shí)，該多重RT-PCR分型法不需要進(jìn)行多次PCR擴(kuò)增，在數(shù)小時(shí)內(nèi)就可完成對(duì)AIV H5亞型的快速檢測(cè)鑒別，能夠在分型同時(shí)一步鑒定到亞型，達(dá)到快速診斷和鑒別AIV的雙重目的，對(duì)及時(shí)有效控制AIV感染有重要意義，對(duì)AIV H5亞型感染制定有效的防制措施具有實(shí)用價(jià)值和指導(dǎo)意義。

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