摘要：對(duì)來(lái)自蘇中地區(qū)25個(gè)疑似感染多殺性巴氏桿菌的規(guī)?；i場(chǎng)隨機(jī)采取的250份病料進(jìn)行了涂片鏡檢、分離純化、生化試驗(yàn)、菌落熒光檢測(cè)、菌體血清型鑒定、PCR鑒定和動(dòng)物試驗(yàn)。結(jié)果分離出4個(gè)豬場(chǎng)共21株多殺性巴氏桿菌，21株多殺性巴氏桿菌中共檢測(cè)出3個(gè)血清型，其中5型17株，1型3株和3型1株。通過(guò)對(duì)蘇中地區(qū)豬多殺性巴氏桿菌流行情況的初步調(diào)查，為豬巴氏桿菌病的快速診斷和科學(xué)防治提供了重要依據(jù)。

關(guān)鍵詞：豬；多殺性巴氏桿菌；分子流行病學(xué)；調(diào)查；蘇中地區(qū)

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2013）04-0022-03

多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida，Pm）是一種重要的病原菌，對(duì)多種動(dòng)物和人均有致病性，常引起豬發(fā)生肺炎和萎縮性鼻炎（Atrophic rhinitis，AR），也是豬呼吸道疾病綜合征（porcine respiratory disease complex，PRDC）的重要致病因子之一[1]。近年來(lái)，蘇中地區(qū)部分規(guī)?；i場(chǎng)受多殺性巴氏桿菌的侵害呈逐年上升趨勢(shì)，尤其是與其他病毒和細(xì)菌的混合感染、繼發(fā)感染。為此，對(duì)本地區(qū)豬場(chǎng)多殺性巴氏桿菌的分子流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查是十分必要的，可為預(yù)防和控制該病在本地區(qū)的流行提供重要依據(jù)。

1 材料及設(shè)備

1.1 檢測(cè)病料

2011年8月至2012年12月，從蘇中地區(qū)25個(gè)疑似感染多殺性巴氏桿菌的規(guī)?；i場(chǎng)采取豬耳靜脈血、肺、心血、腦、脾、淋巴結(jié)等共250份病料。

1.2 主要試劑材料及儀器設(shè)備

1.2.1 主要培養(yǎng)基 血清和鮮血瓊脂平板、鮮血瓊脂斜面、麥康凱瓊脂平板和普通肉湯培養(yǎng)基等，以上培養(yǎng)基均按常規(guī)方法制備。

1.2.2 主要試劑 生化試驗(yàn)的糖或醇；革蘭氏和美藍(lán)染液；MR、VP、接觸酶、脲酶等試驗(yàn)用的試劑；Taq DNA聚合酶、dNTPs、DL2000 DNA Marker等均購(gòu)自正規(guī)廠家。

1.2.3 主要儀器設(shè)備 凝膠成像系統(tǒng)、電泳儀、PCR擴(kuò)增儀、CO2培養(yǎng)箱、超低溫冰箱、生物顯微鏡等。上述儀器設(shè)備均由江蘇省動(dòng)物流行病學(xué)研究中心提供。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

健康綿羊4只、健康小白鼠若干只，由江蘇畜牧獸醫(yī)職業(yè)技術(shù)學(xué)院教學(xué)動(dòng)物醫(yī)院提供。

2 方法

2.1 病料采取

從蘇中地區(qū)25個(gè)疑似感染多殺性巴氏桿菌的規(guī)模化豬場(chǎng)，每個(gè)豬場(chǎng)隨機(jī)采取10份，共250份疑似病料。生前無(wú)菌采取疑似病豬耳靜脈血，死后6 h內(nèi)剖檢尸體無(wú)菌采取新鮮的肺、心血、腦、脾、淋巴結(jié)等材料。

2.2 分離鑒定

2.2.1 涂片鏡檢 將上述疑似病料分別按照常規(guī)染色法進(jìn)行革蘭氏染色和美藍(lán)染色，然后鏡檢。

2.2.2 分離純化 將鏡檢結(jié)果為革蘭氏陰性，且美藍(lán)染色為兩極濃染桿菌的疑似病料劃線(xiàn)接種于血清瓊脂平板和綿羊鮮血瓊脂平板，置于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h后，挑取圓形、透明、直徑1～2 mm的灰白色可疑菌落，抹片革蘭氏染色和美藍(lán)染色，顯微鏡下觀察其細(xì)菌的形態(tài)特點(diǎn)。同時(shí)，挑取上述典型菌落劃線(xiàn)接種于綿羊鮮血瓊脂斜面上，進(jìn)行純培養(yǎng)。取純培養(yǎng)的單個(gè)典型菌落進(jìn)行革蘭氏染色和美藍(lán)染色，鏡檢觀察純培養(yǎng)后細(xì)菌的形態(tài)和染色特點(diǎn)。并將純培養(yǎng)物接種于鮮血瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板和普通肉湯培養(yǎng)基，37 ℃有氧條件下培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)立另一組在厭氧條件下培養(yǎng)，觀察其生長(zhǎng)特性。

2.2.3 生化試驗(yàn) 將接種分離菌的24 h純培養(yǎng)物，做水楊酸、葡萄糖、果糖、甘露醇、半乳糖、蔗糖、甘露糖、山梨醇、乳糖、鼠李糖、菊糖、麥芽糖、阿拉伯明膠等糖（醇）發(fā)酵試驗(yàn)。并按常規(guī)方法分別進(jìn)行硫化氫試驗(yàn)、脲酶試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、MR試驗(yàn)和VP試驗(yàn)。

2.2.4 菌落熒光檢測(cè) 將純培養(yǎng)物劃線(xiàn)接種于血瓊脂平板上，37 ℃培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果。

2.2.5 菌體血清型鑒定 按照相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的多殺性巴氏桿菌菌體血清型抗原的常規(guī)鑒定方法操作[2]。

2.3 PCR鑒定

將上述純化初步鑒定的細(xì)菌進(jìn)一步用PCR方法確定。用滅菌接種環(huán)取少許被檢純培養(yǎng)后菌落與100 μL無(wú)菌PBS液混勻，取1 μL菌懸液作PCR模板。按照唐先春等[3]的豬多殺性巴氏桿菌PCR鑒定方法操作。根據(jù)巴氏桿菌Kmtl基因（NO.AF016259）序列設(shè)計(jì)引物，P1：5'-GGTCT-TAGATGAGCGACAAGG-3'，P2： 5'-GCGCTAT-TACTTCCTTCGTTC-3'， 擴(kuò)增片段大小為457 bp，引物由某正規(guī)公司合成。反應(yīng)體系（50 μL）：10×緩沖液5 μL，2 mmol/L dNTPs 1 μL，10 μmol/L上下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶 1 μL，模板1 μL，滅菌ddH2O 40 μL。反應(yīng)條件：94 ℃變性4 min，94 ℃ 1 min，59 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，回收測(cè)序。

2.4 動(dòng)物試驗(yàn)

將分離菌純培養(yǎng)物接種于血清肉湯培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h。用生理鹽水將培養(yǎng)懸液稀釋成菌數(shù)約為109 CFU/mL，分別腹腔注射5只健康小白鼠，0.2 mL/只，同時(shí)設(shè)立生理鹽水陰性對(duì)照組。在接種后72 h內(nèi)觀察小白鼠死亡情況，并剖檢小白鼠，觀察其病理變化，且采取小白鼠心血等病料組織涂片，染色鏡檢，并進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定。

3 結(jié)果

3.1 鏡檢結(jié)果

鏡檢可見(jiàn)25個(gè)疑似豬場(chǎng)中有4個(gè)豬場(chǎng)、250份疑似病料中共有21份存在可疑病菌。鏡下觀察到的細(xì)菌為革蘭氏陰性球狀短桿菌，散在或成對(duì)存在，美藍(lán)染色為兩極濃染的球狀桿菌，有莢膜。

3.2 分離鑒定結(jié)果

3.2.1 分離純化鑒定結(jié)果 21株疑似病原菌在血清瓊脂平板和鮮血瓊脂平板上均長(zhǎng)成邊緣整齊、表面光滑、濕潤(rùn)、露珠樣的細(xì)小菌落，在鮮血瓊脂平板上無(wú)溶血現(xiàn)象。對(duì)分離菌進(jìn)行純培養(yǎng)，純培養(yǎng)物為革蘭氏陰性短桿菌，無(wú)芽孢，兩極著色不明顯，美藍(lán)染色兩極濃染明顯，多數(shù)為單個(gè)存在。純培養(yǎng)物為需氧或兼性厭氧菌，無(wú)運(yùn)動(dòng)性。再次接種在鮮血瓊脂平板上，呈現(xiàn)露珠樣的細(xì)小菌落，無(wú)溶血；在麥康凱瓊脂平板上不生長(zhǎng)；在普通肉湯培養(yǎng)基中，液面開(kāi)始輕度渾濁，4～5 d后液體變得清晰，管底出現(xiàn)粘稠沉淀，振蕩后不渾濁、不分散，表面形成菌環(huán)。

3.2.2 生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果 24 h后純培養(yǎng)物能發(fā)酵葡萄糖、果糖、甘露醇、半乳糖、蔗糖、甘露糖、山梨醇和麥芽糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；不能發(fā)酵水楊酸、乳糖、鼠李糖、菊糖和阿拉伯明膠；脲酶試驗(yàn)、MR試驗(yàn)和VP試驗(yàn)均為陰性；硫化氫試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)均為陽(yáng)性。

3.2.3 菌落熒光檢測(cè)與血清型鑒定結(jié)果 純培養(yǎng)物在血瓊脂平板上37 ℃培養(yǎng)24 h后，菌落450折光于低倍顯微鏡下觀察，可觀察到菌落呈藍(lán)綠色帶金光、邊緣狹窄的紅黃熒光。在鑒定的21株多殺性巴氏桿菌中共有3個(gè)血清型，其中5型的17株、1型的3株及3型的1株。

3.3 PCR鑒定結(jié)果

對(duì)以上分離鑒定的可疑菌株再進(jìn)行PCR鑒定，產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)到的大小均一致，與預(yù)期大小高度一致。PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序分別與巴氏桿菌Kmtl基因（NO.AF016259）序列同源性在98.31%以上，擴(kuò)增序列同源性較高，引物也設(shè)計(jì)合理，可用于病原菌的快速鑒定。結(jié)合以上鑒定結(jié)果，共鑒定出豬多殺性巴氏桿菌21株，并主要來(lái)自肺部。

3.4 動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果

接種病料的小白鼠均在1 d內(nèi)全部死亡，生理鹽水陰性對(duì)照組的小白鼠全部存活。剖檢死亡小白鼠，可見(jiàn)腹腔液明顯增多，心包和胸腔有不同程度的漿液性纖維素性滲出物，心內(nèi)外膜、腸黏膜出血，肝、淋巴結(jié)腫大。采取死亡小白鼠病料涂片鏡檢，鏡下觀察到的細(xì)菌為革蘭氏陰性短桿菌，美藍(lán)染色具有明顯的兩極特性，有莢膜。進(jìn)一步分離鑒定與病豬的結(jié)果一致。

4 小結(jié)與討論

（1）本試驗(yàn)于2011年8月至2012年12月從蘇中地區(qū)25個(gè)疑似感染多殺性巴氏桿菌的規(guī)?；i場(chǎng)隨機(jī)采取的250份疑似病料，通過(guò)分離培養(yǎng)、染色鏡檢、生化試驗(yàn)、PCR鑒定和動(dòng)物試驗(yàn)等方法，共分離出4個(gè)豬場(chǎng)21株豬多殺性巴氏桿菌，豬場(chǎng)感染率為16.0%，總分離率為8.4%。這說(shuō)明豬多殺性巴氏桿菌感染在蘇中地區(qū)還比較普遍，流行情況較為嚴(yán)重，已經(jīng)對(duì)蘇中地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成潛在的威脅，成為養(yǎng)豬業(yè)的主要呼吸道疾病之一，因此應(yīng)引起各養(yǎng)豬場(chǎng)和動(dòng)物防疫部門(mén)的高度重視。同時(shí)，豬場(chǎng)的感染率高于總分離率，這是由于目前養(yǎng)殖場(chǎng)還是以抗生素進(jìn)行豬病防治，并長(zhǎng)期、大量使用該類(lèi)藥物所致，這樣將會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌的抗藥性越來(lái)越強(qiáng)，治療效果將會(huì)越來(lái)越差，應(yīng)引起重視。

（2）多殺性巴氏桿菌的菌體血清型較多，采用常規(guī)分離鑒定方法鑒定出豬多殺性巴氏桿菌的菌體血清型多為1、2和5型[2]。本次試驗(yàn)在鑒定的21株多殺性巴氏桿菌中共有3個(gè)血清型，其中常見(jiàn)的5型有17株，1型的3株和不常見(jiàn)的3型1株，這與相關(guān)報(bào)道一致。

（3）本試驗(yàn)在細(xì)菌的初步染色鏡檢時(shí)發(fā)現(xiàn)菌株有莢膜，通過(guò)分離培養(yǎng)和純培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)莢膜不明顯，且兩極濃染現(xiàn)象也不明顯。在通過(guò)動(dòng)物接種試驗(yàn)后，再次用試驗(yàn)動(dòng)物病料染色中又發(fā)現(xiàn)了莢膜，這與有關(guān)報(bào)道基本一致，多殺性巴氏桿菌的莢膜是主要的毒力因子，強(qiáng)毒株是有莢膜的，弱毒株一般是無(wú)莢膜，并且莢膜的形成受到培養(yǎng)物的影響，當(dāng)培養(yǎng)物中鐵受到限制時(shí)，莢膜物質(zhì)會(huì)顯著減少[2]。因此，此次試驗(yàn)表明分離的細(xì)菌具有較強(qiáng)的致病力，說(shuō)明此時(shí)間段蘇中地區(qū)部分規(guī)?；i場(chǎng)受到較強(qiáng)毒株的感染。在動(dòng)物試驗(yàn)中，感染的小白鼠在1 d內(nèi)全部死亡，也說(shuō)明分離的巴氏桿菌具有較強(qiáng)的致病力。

（4）多殺性巴氏桿菌在分離鑒定時(shí)，其菌落、菌體形態(tài)特征與很多細(xì)菌相似，如其他溶血巴氏桿菌、嗜肺巴氏桿菌、波氏桿菌、放線(xiàn)桿菌等都為革蘭氏陰性桿菌，都有兩極著色特性[1]。因此，采用常規(guī)染色、生化等方法鑒定難度較大。而PCR引物具有很強(qiáng)的靈敏度和特異性，大大降低了分離細(xì)菌工作的難度。所以采取PCR鑒定技術(shù)結(jié)合生化等試驗(yàn)，可明顯提高多殺性巴氏桿菌的分離鑒定率和準(zhǔn)確度，完全適合應(yīng)用于該病的流行病學(xué)調(diào)查。

（5）多殺性巴氏桿菌是規(guī)模化豬場(chǎng)的一種重要病菌，嚴(yán)重影響豬群健康及飼料利用率。因此，對(duì)蘇中地區(qū)部分規(guī)模化豬場(chǎng)進(jìn)行多殺性巴氏桿菌的分離鑒定，為該病的快速診斷提供了科學(xué)依據(jù)。同時(shí)，對(duì)多殺性巴氏桿菌在蘇中地區(qū)的流行情況進(jìn)行初步調(diào)查，更有利于對(duì)豬巴氏桿菌病的防治提供科學(xué)指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 徐引弟，王治方，朱文豪，等.豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)[J].中國(guó)獸藥雜志，2011，45（5）：5-7.

[2] 李 冰，曲祖乙，趙金梅.豬巴氏桿菌病病原的分離與鑒定[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2008，35（11）：115-117.

[3] 唐先春，吳 斌，索緒峰，等.豬多殺性巴氏桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特性研究[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2005，36（6）：590-595.