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        mRNA 差異顯示技術(shù)研究綜述

        2013-01-01 00:00:00董麗艷孫思宇
        湖北畜牧獸醫(yī) 2013年4期

        摘要:分析一對(duì)細(xì)胞或組織在不同狀態(tài)下基因表達(dá)的差異,已成為分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一,用于識(shí)別差異表達(dá)基因的方法有多種,DDRT-PCR 是近年來較為廣泛應(yīng)用的一種技術(shù)。DDRT-PCR 技術(shù)有很多優(yōu)點(diǎn),但同時(shí)也存在不少問題,通過對(duì)其進(jìn)行不斷地改進(jìn)使這項(xiàng)技術(shù)在分子生物學(xué)中能更好更廣地應(yīng)用。

        關(guān)鍵詞:mRNA;差異顯示;PCR

        中圖分類號(hào):Q343 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:B 文章編號(hào):1007-273X(2013)04-0068-03

        高等生物的細(xì)胞中約有1.5萬個(gè)基因處于表達(dá)狀態(tài),但只有15%的基因得以表達(dá)?;虻牟町惐磉_(dá)不僅是細(xì)胞形態(tài)和功能多樣性的根本原因,同時(shí)也是各種生理及病變過程的物質(zhì)基礎(chǔ)。比較不同細(xì)胞間或同一細(xì)胞不同時(shí)間與空間基因表達(dá)的差異,分析與病理變化相關(guān)的特異性表達(dá)基因,對(duì)生物學(xué)及相關(guān)學(xué)科的研究有重要意義[1]。

        20世紀(jì)90年代初,Bauer等[2]在AP-PCR 和RT-PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上建立了mRNA 差異顯示或稱差異顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR(Differential Display reverse transcription PCR,DDRT-PCR),是一種有效的篩選差異表達(dá)基因的方法。1994年Erric Haay等將這種方法正式命名為差異顯示反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(DDRT-PCR)。與研究DNA 差異相比,研究mRNA 的差異排除了非編碼區(qū)的影響,使研究范圍縮小到表達(dá)基因水平上,為人類進(jìn)一步了解生命過程提供了一個(gè)工具。

        1 mRNA 差異顯示技術(shù)的原理及技術(shù)路線

        mRNA 差異顯示技術(shù)是在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行分析的。成熟的mRNA的 3′端具有poly(A)尾巴,以一系列Olige(dT) 12MN 引物中的一種(M、N分別代表A、C、T、G四種堿基中的一種,M 不能為T)錨定于兩種或兩種以上一條mRNA,再于變性PAGE膠上分離目的片段,并就基因表達(dá)的差異對(duì)比材料的mRNA的poly(A)尾部。在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下,逆轉(zhuǎn)錄真核細(xì)胞中全部表達(dá)的mRNA,可獲得1/12 cDNA,同時(shí)5′端設(shè)計(jì)一組隨機(jī)引物,通過PCR 擴(kuò)增,進(jìn)行比較。將有差異的基因片段從凝膠上切割下來,用相同的錨定引物和隨機(jī)引物對(duì)分離的片段進(jìn)行二次擴(kuò)增,得到差異片段后將該片段克隆、測(cè)序,并同基因庫的序列進(jìn)行同源性比較或者將差異顯示的DNA 克隆測(cè)序后作為探針,進(jìn)行斑點(diǎn)雜交和Northern 印跡確保是否是真陽性結(jié)果,以進(jìn)一步分析其功能。

        2 實(shí)驗(yàn)材料的選擇

        在細(xì)胞或組織選擇方面應(yīng)盡可能使相互比較的樣本在基因型上一致或比較接近, 以減少非相關(guān)帶的檢測(cè)。對(duì)于培養(yǎng)的細(xì)胞而言, 互相比較的細(xì)胞應(yīng)在相同的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。高質(zhì)量的RNA是DDRT-PCR 技術(shù)成功的關(guān)鍵因素之一。另外, 在進(jìn)行DDRT-PCR實(shí)驗(yàn)時(shí), 所有的PCR 反應(yīng)最好都應(yīng)用同一來源的Taq DNA 聚合酶,因?yàn)椴煌瑏碓吹腡aq DNA 聚合酶的貯存緩沖液及其在貯存和反應(yīng)溫度下的活力可能會(huì)存在差異, 從而可能會(huì)導(dǎo)致DNA 帶型的差異。

        3 mRNA 差異顯示技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)及缺陷

        DDRT-PCR 技術(shù)通過對(duì)一系列引物的組合利用,能夠在較短的時(shí)間內(nèi)獲得差異顯示基因,該方法具有很多優(yōu)點(diǎn),如敏感(可鑒定低豐度的mRNA)、快速、易操作等。然而在實(shí)際操作中仍存在一些問題,主要表現(xiàn)為假陽性率高、對(duì)高豐度mRNA 具有明顯的傾向性[3]、易引起污染(因?yàn)槠鸪醯膍RNA 差異顯示技術(shù)是通過同位素進(jìn)行放射自顯影顯示差異條帶的圖像的),此外由于某些序列的特異性,一些差異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄不能得到分離[4], 所以凝膠中的單條帶可能由1 種以cDNA 片段所構(gòu)成。

        4 mRNA 差異顯示技術(shù)的改進(jìn)

        針對(duì)mRNA差異顯示技術(shù)存在的問題,人們想到很多新方法來完善這項(xiàng)技術(shù)。

        4.1 引物的改進(jìn)

        最初的錨定引物為Oligo dT12MN(M=A/C/G; N =A/T/C/G),共12種組合,其工作量很大。Liang等[5]將錨定引物先后改為4種兼并引物(T12MA、T12MT、T12MC、T12MG。M=A/C/G)和單堿基錨定引物T11M (M=A/C/G),減少了工作量,增加了重復(fù)性,也提高了分辨率。又將cDNA 分組的數(shù)量減少到3 個(gè)[6],并證明使用3 個(gè)單堿基錨定Oligo(dT) 引物可以解決與使用雙核苷酸豐余引物相關(guān)的大部分問題。隨后也有人用較長(zhǎng)的引物,使問題得到進(jìn)一步改善[7]。

        4.2 PCR的改進(jìn)

        Marten 等建議兩步PCR 法,即開始的4個(gè)循環(huán)為低嚴(yán)謹(jǐn)性,后面則采用高嚴(yán)謹(jǐn)?shù)腜CR 循環(huán),他將此技術(shù)稱為EDD(Enhanced diffferential display)。推薦的PCR 參數(shù)為:開始3 個(gè)低嚴(yán)謹(jǐn)循環(huán):第一個(gè)循環(huán),94 ℃變性5 min,40 ℃退火5 min,68 ℃延伸 5 min;接著兩個(gè)循環(huán):94 ℃變性2 min,40 ℃退火5 min,68 ℃ 延伸5 min;后面的22~25個(gè)為高嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难h(huán): 94℃變性1 min, 60 ℃退火1 min, 68 ℃延伸2 min, 然后68 ℃延伸7 min。經(jīng)過改進(jìn),不僅保持差異帶的特征性,而且顯著地增強(qiáng)了重復(fù)性和敏感性。

        4.3 提高低拷貝mRNA 的差異顯示率

        DDRT-PCR 對(duì)高拷貝mRNA 有很強(qiáng)的傾向性。在DDRT-PCR 中模板極多,幾乎所有模板的啟動(dòng)均有引物錯(cuò)配,而且dNTPS的濃度極低,因而造成競(jìng)爭(zhēng)機(jī)制,使DDRT-PCR 產(chǎn)物更傾向于高拷貝mRNA ,而對(duì)低拷貝檢測(cè)較差。cDNA 末端快速擴(kuò)增法(RACE) 的成功應(yīng)用解決了這一問題,能從微量mRNA和低豐度轉(zhuǎn)錄本中克隆全長(zhǎng)cDNA,利用這項(xiàng)技術(shù)有效地解決了DDRT-PCR中的這一難題[8]。

        4.4 應(yīng)用非放射性同位素

        起初mRNA 差異顯示是通過放射性同位素進(jìn)行放射自顯影顯示差異條帶的圖像,但這種方法易造成污染環(huán)境, 對(duì)人體有害,并且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。為克服這個(gè)缺點(diǎn),采用了非同位素mRNA 差異顯示,現(xiàn)在這項(xiàng)技術(shù)發(fā)展很快[9]。有研究者采用熒光素代替同位素對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記, 電泳分離后的產(chǎn)物可在DNA 測(cè)序儀上讀取,既改善了操作的安全性, 也提高了敏感性和差異顯示的分辨率[10]。

        4.5 電泳的改進(jìn)

        非變性凝膠電泳用在差顯技術(shù)上,降低了顯示譜帶的復(fù)雜性,同時(shí)簡(jiǎn)化了后期進(jìn)行克隆篩選的工作。George等[11]用毛細(xì)管電泳系統(tǒng)對(duì)熒光標(biāo)記的表達(dá)序列標(biāo)簽進(jìn)行快速自動(dòng)化識(shí)別, 而且該電泳系統(tǒng)經(jīng)改造后可用于cDNA 帶的收集。

        4. 6 應(yīng)用反向Northern 印跡雜交

        為了排除假陽性的干擾,可以采用反向Northern 印跡雜交來驗(yàn)證[12,13]。反向Northern 印跡雜交是一種比較節(jié)省、快速的方法[14],可以在一次試驗(yàn)中檢測(cè)出將全部待測(cè)的片段。李子銀等[15]通過制備兩個(gè)cDNA 探針進(jìn)行兩輪反Northen 雜交結(jié)合質(zhì)粒酶切圖譜分析,建立一種快速篩選差異陽性cDNA 的方法,獲得的陽性克隆cDNA 可以用作探針獲取全長(zhǎng)序列。

        5 展望

        mRNA差異顯示技術(shù)在逐漸完善,因其具有操作簡(jiǎn)便、快速,一次能分析多個(gè)樣品等優(yōu)點(diǎn)而給研究帶來了諸多便利, 在多種基因檢測(cè)技術(shù)中,mRNA 差異顯示技術(shù)作為研究細(xì)胞、組織在不同條件下基因表達(dá)水平差異的重要手段,不僅應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)[16,17]也廣泛應(yīng)用于動(dòng)物遺傳育種[18-21]、動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)[22]等領(lǐng)域。經(jīng)過不斷地改進(jìn)和完善,它已經(jīng)成為生物醫(yī)學(xué)以及農(nóng)業(yè)技術(shù)的一個(gè)很好的研究工具。

        參考文獻(xiàn):

        [1] 池曉菲,舒 慶.開放的差異基因表達(dá)技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào),2002,18(3):259-264.

        [2] BAUER D, MUELLER H, REICH H, et al. Identification of differentially expressed mRNA species by an improved display technique(DDRT-PCR)[J]. Nucleic Acids Res.1993,21:4272-4280.

        [3] BERTIOLI D J , SCHLICHTER U H , ADAMS M J , et al. An analysis of differential display shows a strong bias towards high copy number mRNAs[J]. Nucleic Acids Research ,1995,23(21):4520-4523.

        [4] GHOSH S A. Novel ligation mediated PCR based strategy for constructionof subtraction libraries from limiting amounts of mRNA[J].Nucleic Acids Research,1996,24(4):795-796.

        [5] Liang P,PARDEE A. Distribution and cloning of eukaryotic mRNA by means of differential display : refinemeng and optimization[J]. Nucleic Acid Research,1993,21(14):3269-3275.

        [6] LIANG P, ZHU W, ZHANG X, et al. Differential display using one base anchored oligo-dT primers[J].Nucleic Acids Res,1995,22: 5763-5764.

        [7] DIACHENKO L B , LEDESMA J , CHENCHIK A A,et al. Combining the technique of RNA fingerprinting and differential display to obtain differentially expressed mRNA[J]. Biochem Biophys Res Commun,1996,219(3):824-828.

        [8] FROHMAN M A, DUSH M K.MARTIN G R.Rapid production of full-length cDNAs from rare amplification using a single gene-specific oligonucleotide primer[J].Natl Acid Sci,1998,85 :89-98.

        [9] 蘇 青,羅 敏,劉紅標(biāo),等. 非同位素mRNA差異顯示方法的建立及應(yīng)用[J]. 上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2000,20 (5):405-407.

        [10] ITO T ,KITO K,ADATI N,et al. Flourescent differential display : arbitrarily primed RT-PCR fingerprinting on an automated DNA sequencer[J] .FEBS Lett,1994,351(2): 231-236.

        [11] GEORGE K S, ZHAO X, GALLAHAN D, et al. Capillary electrophoresis methodology for identification of cancer related gene expression patterns of fluorescent differential display polymerase chain reaction.[J]Chromatogr B Biomed Sci Appl ,1997,695(1): 93-102.

        [12] ZHANG H, ZHANG R, LIANG P. Differential screening of gene expression difference enriched by differential display[J].Nucleic Acids Research,1996,24(12):24-28.

        [13] LOHMANN J, SCHICKLE H, BOSCH TCG. REN display, a rapid and efficient method for monradioactive differential display and mRNA isolation[J].Bio Techniques,1995,1(2):200-202.

        [14] 劉 紅,任笑蒙,陳蘭英.一種快速篩選陽性克隆的方法-反向Northern 印跡雜交技術(shù)[J].基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床,2002,22(3):278-280.

        [15] 李子銀,陳受宜.mRNA差異顯示陽性CDNA克隆的快速篩選與鑒定[J].高科技通訊,1999,(8):44-48.

        [16] 鄭 潔,耿 鑫.mRNA差異顯示技術(shù)及其在腫瘤研究中的應(yīng)用[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)腫瘤學(xué)分冊(cè), 2004,31(1):30-33.

        [17] 茍德明,李文鑫. 用改進(jìn)的DDRT-PCR技術(shù)進(jìn)行人胚差異基因篩選[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2000,27(2):205~209.

        [18] 褚曉紅,胡錦平,翁經(jīng)強(qiáng).mRNA差異顯示技術(shù)及其在動(dòng)物遺傳研究中的應(yīng)用[J].黃牛雜志,2004,30(1):30-35.

        [19] JANZEN M A , KUHLERS D L , JUNGST S B ,et al. ARPP - 16 mRNA is up - regulated in the longissimus muscle of pigs possessing an elevated growth rate[J].Animal Sci,2000,78(6):1475-1484.

        [20] ZHU Y, WANG M. Identification of estrogen-responsive genes in chick liver[J] .Cell Tissue Res,2001,305(3):357-363.

        [21] ROBERT C, GAGNE D, et al.Differential display and suppressive subtractive hybridization used to identify granulosa cell messenger rna associated with bovine oocyte developmental competence[J].Biol Reprod,2001,64(6):1812-1820.

        [22] 王蘭芳,樂國(guó)偉.mRNA差異顯示技術(shù)在營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究中的應(yīng)用[J].動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué),2001,18(3):15-16.

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