摘要：核移植后的重構胚，只有卵母細胞質(zhì)被激活后才能啟動發(fā)育，低的核移植胚發(fā)育率可能與卵母細胞質(zhì)未充分激活有關。對核移植中卵母細胞激活方法進行了綜述。對常用的幾種激活方法及其激活原理進行了介紹。

關鍵詞：核移植；卵母細胞；激活方法

中圖分類號：S813.3 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2013）04-0074-04

核移植后的重構胚，只有卵母細胞質(zhì)被激活后才能啟動發(fā)育，低的核移植胚發(fā)育率可能與卵母細胞質(zhì)未充分激活有關。目前，用于卵母細胞激活的方法主要分為單一激活和聯(lián)合激活。常用的單一激活主要有電激活、鈣離子載體A23187、離子霉素（Ionomycin）及乙醇等；聯(lián)合激活主要是單純的物理刺激或化學刺激以后再用蛋白質(zhì)合成抑制劑或蛋白質(zhì)磷酸化抑制劑或細胞松弛素B聯(lián)合處理的一種激活方式。現(xiàn)在越來越多的研究證明聯(lián)合激活比單一的電激活或化學激活效果好，下面簡要介紹幾種常用的激活方法及其激活原理。

1 激活方法

1.1 電激活

電刺激是在核移植中常用的激活方法。因該方法具有操作方便、激活率高和無化學毒副作用等特點而被廣大研究者所青睞。早在1989年，Onodera和Tsunoda的研究表明小鼠和兔卵母細胞在施以直流電脈沖后可發(fā)育到囊胚期。在小鼠、兔、牛、豬的研究中都發(fā)現(xiàn)一次直流電脈沖只誘發(fā)一個鈣離子瞬間波峰，而不是象受精一樣引起的是鈣離子波動。盡管如此，一次或兩次電脈沖就可以激活大部分卵母細胞。電激活的原理是卵母細胞在短暫高壓直流電脈沖的作用下，膜的磷酸二酯雙分子結(jié)構的穩(wěn)定性發(fā)生改變，細胞膜上形成很多可恢復的微小孔洞，使細胞外的Ca2+進入細胞，并使胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高，細胞內(nèi)Ca2+濃度的增加導致CSF活性消失，cyclinB被迅速降解，MPF活性消失，細胞被激活完成第二次減數(shù)分裂并進入下一細胞周期。早期的研究表明核移植胚胎進行簡單的電激活就如同卵母細胞孤雌激活一樣，雖然可以得到進一步的發(fā)育，但激活效率較低而且電激活常常依賴于卵母細胞成熟時間[1]，卵齡越高CSF對Ca2+就越敏感，進而卵母細胞就越容易激活。目前的研究結(jié)果表明，一次電刺激可誘導一次Ca2+升高，多次電刺激可出現(xiàn)多次Ca2+升高。通過控制電刺激參數(shù)，模擬正常受精過程中Ca2+的節(jié)律性脈沖升高，可復制出正常受精過程的一系列生理學和形態(tài)學變化，啟動MII期卵母細胞繼續(xù)成熟分裂，步入正常發(fā)育軌道[2]。電刺激下卵母細胞電激活率與卵母細胞的卵齡、電場強度、脈沖持續(xù)時間及次數(shù)有關，但各種動物在這些參數(shù)上存在差異[3]。閻新龍等[4]報道用1.5 kV/cm，30 μs，2次脈沖（間隔3 s）對豬體細胞核移植胚激活可以獲得較好的桑葚胚率；劉國世等[5]報道用1.3 kV/cm，80 μs，1次脈沖對豬體外成熟卵母細胞進行孤雌激活可以獲得較高的囊胚率；而馬利兵[6]則認為1 kV/cm，30 μs和2次脈沖（間隔1 min）是激活小鼠卵母細胞的最佳電脈沖參數(shù)。

1.2 鈣離子載體A23187和離子霉素（Ionomycin）

鈣離子載體A23187（CaA）主要通過胞質(zhì)內(nèi)Ca2+的釋放來激活卵母細胞[7、8]。離子霉素作為另一種鈣離子載體，也是通過卵母細胞內(nèi)Ca2+的釋放而發(fā)揮功能的[9]。但是它不是直接促進卵母細胞內(nèi)Ca2+的釋放，而是先動用細胞膜上Ca2+通道由細胞外向胞內(nèi)涌入，然后又刺激內(nèi)源性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+進入卵母細胞質(zhì)內(nèi)[10]。鈣離子載體A23187和離子霉素也是一類目前最常用和最有效的哺乳動物卵母細胞的激活物質(zhì)，但是這種激活沒有電刺激簡單省事，因為電激活時有半數(shù)以上卵母細胞激活后形成一個以上原核，而且無第二極體排出。而用鈣離子載體A23187和離子霉素對克隆胚胎進行激活時，會有第二極體的排出，為抑制卵母細胞釋放第二極體，常需要再在含蛋白質(zhì)合成抑制劑或磷酸化抑制劑的培養(yǎng)液中孵育一定的時間[11]。

1.3 乙醇激活

乙醇對卵母細胞的激活主要是引起細胞膜IP3的形成，通過IP3受體介導內(nèi)源性Ca2+釋放，引起卵母細胞產(chǎn)生激活的早期反應。乙醇誘導Ca2+濃度升高持續(xù)時間較長，比受精過程中和任何其他化學激活誘導的Ca2+濃度升高持續(xù)時間都長。乙醇處理可以有效的激活小鼠、牛、豬、綿羊的卵母細胞。但在兔、山羊上的效果并不理想[12]。通常，卵母細胞在含有7%～8%乙醇的培養(yǎng)液中孵育5～7 min就足以激活卵母細胞而形成原核，有些甚至能發(fā)育到囊胚，然而延長乙醇的孵育時間就會抑制這一作用[13]。如果單獨使用乙醇，其激活效果并不理想。對于豬卵母細胞，5%、7%和10%的乙醇的激活率分別是3%、12%和15%[14]。如果乙醇與放線菌酮素（CHX）聯(lián)合使用則可有效提高牛卵母細胞的激活率和孤雌胚的發(fā)育率[15]。李光鵬等[16]的研究也表明乙醇與CHX聯(lián)合使用顯著提高了豬卵母細胞的激活率。Chenko等報道用乙醇配合CHX+CB激活的體細胞核移植胚胎，已經(jīng)產(chǎn)出小犢。

1.4 蛋白質(zhì)合成抑制劑

蛋白類細胞因子成熟促進因子（MPF）和細胞靜止因子（CSF）是細胞周期的調(diào)節(jié)者，正是因為在二者的作用下卵母細胞才會停滯在MII期。這些因子對Ca2+十分敏感，當卵激活胞質(zhì)Ca2+升高到一定水平時，MPF和CSF便失活或消失。使用蛋白質(zhì)合成抑制劑激活卵母細胞不是因為能引起Ca2+濃度波動而起作用，而是因為能抑制這些蛋白質(zhì)類細胞因子的合成，從而使卵母細胞離開MII期，恢復第二次減數(shù)分裂[15]。目前常用的蛋白質(zhì)合成抑制劑有嘌呤霉素、肌霉素和CHX。CHX主要通過抑制cyclinB的合成，從而抑制了MPF的合成，而MPF正是卵母細胞維持在MII期所需的細胞因子，這樣就使得卵母細胞內(nèi)MPF活性迅速下降，導致卵母細胞激活。CHX不抑制蛋白質(zhì)的磷酸化，故不影響構成紡錘體的微管蛋白的活性，不影響第二極體的排出[16]。因此，在用CHX激活卵母細胞時需要與細胞松弛素B協(xié)同作用才能抑制第二極體的排出。CHX單獨使用對卵母細胞的激活作用較弱，一般要與可以引起鈣離子波動的其他激活因子協(xié)同作用才可使卵母細胞達到充分激活。CHX與其他因素協(xié)同促進卵母細胞活化的作用機制，一般認為電脈沖、離子霉素和乙醇等的刺激已經(jīng)導致卵母細胞的活化，而CHX的作用是進一步抑制卵母細胞內(nèi)新的相關蛋白的合成，使之不能產(chǎn)生新的CSF和MPF，使MPF一直處于低水平，因此又進一步促進卵母細胞的活化。2005年，Kragh等利用電激活+CHX+CB的激活方法對豬卵母細胞進行了無透明帶的克隆，其囊胚率高達21%。

1.5 蛋白質(zhì)磷酸化抑制劑

蛋白質(zhì)磷酸化抑制劑能阻止蛋白質(zhì)的磷酸化進而抑制MPF和CSF的活性，同時也抑制了第二極體的排放，保證了孤雌激活卵母細胞的染色體為二倍體[18] 。6-二氨基甲基嘌呤（6-dimethylaminopurine，6-DMAP）是一種廣泛應用的蛋白質(zhì)磷酸化抑制劑，它阻止蛋白質(zhì)的磷酸化進而抑制MPF和CSF的活性，同時抑制了紡錘體形成時微管蛋白的磷酸化進而抑制了極體的排出，但6-DMAP不影響DNA的合成[19，20]。它對卵母細胞的激活作用主要是維持p34cdc2的磷酸化和抑制cyclinB的磷酸化，抑制MPF的活性，同時由于cyclinB的降解導致MPF活性下降，細胞分裂由MII期向末期II發(fā)展，從而使卵母細胞被激活。6-DMAP同CHX一樣單獨使用時對卵母細胞的激活作用較弱，也要與可以引起Ca2+波動的因素協(xié)同作用才可以使卵母細胞達到充分激活[21]。Loi等[19]使用6-DMAP與乙醇，CaA，Ion和IP3聯(lián)合激活卵母細胞以及核移植胚時，獲得較好的效果。電刺激+6-DMAP對豬的核移植胚的激活沒有起到提高發(fā)育的作用，但電融合后用6-DMAP+CB進行激活處理，可以提高重組胚的分裂率。

1.6 聯(lián)合激活

到目前為止，有關哺乳動物卵母細胞激活的研究已經(jīng)做了很多，方法由原來的單一激活到現(xiàn)在的各種方法的聯(lián)合使用，已取得了一定的進展?，F(xiàn)已知道聯(lián)合激活比單一激活的激活率和胚胎發(fā)育率都要高。李光鵬等[22]報道，單獨使用乙醇、電脈沖和氯化鍶激活豬卵母細胞，其激活率分別為11.9%、61.3%、41.9%，而將它們與CHX聯(lián)合使用，則其激活率分別升高到27.8%、81.1%、74.5%；Shiga等[23]報道采用電刺激與CHX聯(lián)合處理重構胚，已經(jīng)獲得以成年肌肉細胞為供體核的體細胞克隆牛；蘭國成等[24]報道，單獨使用5%或10%乙醇處理5 min其激活小鼠卵母細胞的激活率只有41.3%和57.9%，單獨使用6-DMAP處理6 h其激活率也只有40%，如果將二者聯(lián)合起來使用，則使激活率分別達到65.5%和100%； Kragh等[17]報道用電激活+CHX+CB的方法對豬卵母細胞進行無透明帶克隆，所獲得的囊胚率高達21%，這比第一次報道的豬的無透明帶克隆的囊胚率（6%）提高了將近4倍，比常規(guī)的顯微操作核移植囊胚率（<10%）提高了將近2倍；李雪峰等[18]比較了幾種不同化學激活方法對牛卵母細胞激活的效果，得出離子霉素+6-DMAP+CB以及乙醇+6-DMAP+CB結(jié)合使用可以有效激活牛卵母細胞，其卵裂率和囊胚發(fā)育率分別為75.5%、24.5%和82.4%、19.4%。離子霉素比乙醇對牛卵母細胞的激活作用強，6-DMAP比CHX的激活效果好，激活液中存在CB對牛孤雌胚胎的發(fā)育有利。由此可見，幾種激活方法的聯(lián)合使用，特別是能夠誘發(fā)胞內(nèi)鈣波的激活方法與蛋白質(zhì)合成抑制劑或磷酸化抑制劑聯(lián)合使用，不但可以提高卵母細胞的激活率，而且還能提高胚胎的發(fā)育率。

2 核移植中卵母細胞激活研究的意義

從事科學研究的目的，一是服務于人類自身，滿足其不斷增長的生活需求；二是使科學本身向前發(fā)展，取得對自然界和人類更高層次的認識。動物克隆是一項很前沿的生物科學領域，對它的深入研究也具有這兩個方面的意義?？寺〖夹g潛在的經(jīng)濟效益是十分巨大的，它是動物育種、繁殖的新概念。應用經(jīng)修飾的細胞群進行核移植，可使動物基因標定變得可行，培育出新的物種，建立重要疾病的基因模型，獲得大量用于生產(chǎn)生物藥物的動物或異種器官移植的動物，使人類的醫(yī)療事業(yè)能邁出飛躍的一步；它可用于加快良種家畜的繁殖，提高良種繁殖的效率，使畜牧業(yè)得到更好的發(fā)展；另外，克隆技術在珍稀動物的繁殖，瀕危動物的拯救方面也有美好的應用前景。當然，目前看來，更具意義的是它的科學含義，讓一個體細胞再重新發(fā)育成一個動物個體本身就是一件具有高度想象力并富有挑戰(zhàn)性的事情，使這一技術走向成熟的過程包含著許許多多的科學機遇，它不僅能推動發(fā)育生物學向前發(fā)展，而且可拓展生命科學的內(nèi)涵，取得對生命現(xiàn)象更加深入的理解。

哺乳動物卵母細胞的人工激活，是細胞核移植技術的關鍵環(huán)節(jié)，卵母細胞激活與核移植成功與否密切相關，因為移植后的卵母細胞的核物質(zhì)被供體細胞核所代替，移入的核物質(zhì)的復制等過程完全依賴于卵母細胞的激活。因此卵母細胞激活研究對于完善核移植技術有著重要的意義和價值。到目前為止，對于克隆的研究已經(jīng)取得了很大的成就，但是其總體效率仍然很低（不超過10%），其中一部分原因是與卵母細胞的未充分激活有關。而且為什么同一種激活方法對于不同的動物其激活的效果會不一樣，究竟那種激活方法效果較好仍然沒有定論，這些現(xiàn)象所蘊含的深層的理論又是什么，這些問題的解決將會大大提高核移植的成功率，使該技術在理論和應用研究中發(fā)揮更重大的作用。

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