摘要：利用經(jīng)篩選多態(tài)性較好的18對(duì)微衛(wèi)星引物，對(duì)新西蘭白兔、福建黃兔進(jìn)行遺傳多樣性檢測(cè)。研究結(jié)果表明，2個(gè)兔品種在18個(gè)微衛(wèi)星座位上的基因頻率存在一定的差異；新西蘭白兔群體的基因雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.593和0.533；福建黃兔群體的基因雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.613和0.560。福建黃兔群體基因平均雜合度和平均多態(tài)信息含量較新西蘭白兔高；說(shuō)明福建黃兔的遺傳多樣性較新西蘭白兔豐富。

關(guān)鍵詞：微衛(wèi)星標(biāo)記；遺傳；多樣性；新西蘭白兔；福建黃兔

中圖分類號(hào)：S829.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2013）04-0008-04

微衛(wèi)星DNA作為第二代分子遺傳標(biāo)記廣泛存在于高等真核生物細(xì)胞的基因組中，是基因組中種類多、分布廣、具有高度多態(tài)性和雜合度的分子標(biāo)記，由于其具有多態(tài)性檢出率高、信息含量大、共顯性標(biāo)記、實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、結(jié)果穩(wěn)定可靠等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為各類遺傳標(biāo)記中最有價(jià)值的一種[1]。自聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織將微衛(wèi)星標(biāo)記作為優(yōu)先推薦的分析工具以來(lái)[2]，國(guó)內(nèi)外許多研究人員也開始利用微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)家兔的遺傳多樣性進(jìn)行分析：如Richardson等[3]利用7個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記分析了澳大利亞5個(gè)群體252個(gè)野兔個(gè)體的遺傳多樣性，結(jié)果顯示歐洲野兔在澳大利亞繁衍過(guò)程中仍保持了遺傳多樣性；謝喜平等[4]通過(guò)16 個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記從DNA 分子水平揭示福建黃兔群體遺傳多態(tài)性，福建黃兔群體中16 個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)共檢測(cè)到了100個(gè)等位基因，各位點(diǎn)的等位基因數(shù)在3～13，平均等位基因數(shù)為6～25個(gè)。

本研究選取經(jīng)篩選多態(tài)性較好18個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記，采用PCR擴(kuò)增檢測(cè)新西蘭白兔、福建黃兔微衛(wèi)星多態(tài)性，以期揭示這2個(gè)兔品種的遺傳多樣性，為家兔種質(zhì)資源的有效保護(hù)和合理利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)對(duì)象選取江蘇省金陵種兔場(chǎng)具備品種特征、健康、發(fā)育良好的新西蘭白兔50只和福建黃兔52只，耳緣靜脈抽取3 mL血樣，肝素鈉抗凝，于-80 ℃下冷凍保存、備用。

1.2 基因組DNA的提取

家兔血液基因組DNA的提取，參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第3版[5]。

1.3 引物的合成及信息

從30對(duì)微衛(wèi)星引物中篩選了多態(tài)性較好的18對(duì)引物。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。18 對(duì)微衛(wèi)星引物及 PCR 反應(yīng)條件如表1所示。

1.4 PCR擴(kuò)增體系及條件

PCR 反應(yīng)體系 20 μL：10×PCR（Mg2+）Buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl2 0.8～1.5 μL，2.5 mmol/L dNTP 1 μL，10 μmol/L 上下游引物各 1μL，Taq DNA 聚合酶 1.0 U，100 ng/μL DNA模板 1 μL，dd H2O 補(bǔ)至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性 45 s，55～60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸 10 min，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物4 ℃保存[6]。

1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物先在2.0%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測(cè)，膠回收后送上海INVETROGEN公司全自動(dòng)測(cè)序儀檢測(cè)。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用QUANTITY ONE 軟件計(jì)算各等位基因大小、微衛(wèi)星座位的等位基因頻率、多態(tài)信息含量、基因雜合度。

2結(jié)果與分析

2.1 各座位的等位基因數(shù)和等位基因頻率

本試驗(yàn)通過(guò)18對(duì)微衛(wèi)星引物檢測(cè)了新西蘭白兔和福建黃兔遺傳多樣性，由表2可知2個(gè)品種在18個(gè)微衛(wèi)星座位共檢測(cè)到106個(gè)等位基因，其中新西蘭白兔有17個(gè)等位基因未檢測(cè)到，而在福建黃兔中檢測(cè)到；福建黃兔有8個(gè)等位基因未檢測(cè)到，而在新西蘭白兔中檢測(cè)到。新西蘭白兔在18個(gè)微衛(wèi)星座位上共檢測(cè)到89個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)目為4.94個(gè)，而福建黃兔檢測(cè)到98個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)目為5.44個(gè)。

2.2 多態(tài)信息含量和基因期望雜合度

2個(gè)兔品種18個(gè)微衛(wèi)星座位上的多態(tài)信息含量（PIC）和基因雜合度（H）見表3。由表3可知，新西蘭白兔群體的基因雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.593和0.533；福建黃兔群體的基因雜合度和多態(tài)信息含量分別為0.613和0.560。新西蘭白兔、福建黃兔平均多態(tài)信息含量較新西蘭白兔高；平均基因雜合度也出現(xiàn)了類似的結(jié)果，說(shuō)明福建黃兔的遺傳多樣性較新西蘭白兔豐富。

3 討論

多態(tài)性是指群體多態(tài)性基因座的比率，遺傳多態(tài)性是指一個(gè)群體中兩種或兩種以上非連續(xù)變異類型并存的現(xiàn)象，自然選擇是造成多態(tài)性的原因之一。對(duì)多態(tài)位點(diǎn)的判斷，一般認(rèn)為群體中某位點(diǎn)有0.01以上頻率的復(fù)等位基因存在時(shí)，該位點(diǎn)為多態(tài)位點(diǎn)，否則為單態(tài)。本研究中多態(tài)性和等位基因頻率結(jié)果表明，多態(tài)性基因頻率分布在0.010～0.923之間，其中有81個(gè)等位基因是2個(gè)兔品種所共有的，被檢測(cè)的18個(gè)微衛(wèi)星座位都為多態(tài)，其中6L3F8基因座的多態(tài)性最豐富，有10個(gè)等位基因。

在2個(gè)家兔品種中，新西蘭白兔的平均多態(tài)信息含量與福建黃兔很接近，都屬于中度多態(tài)。而同一兔品種不同微衛(wèi)星座位上多態(tài)信息含量上的差異，例如，福建黃兔在Sol33位點(diǎn)PIC為0.260，呈

低度多態(tài)性；而在6L1F10位點(diǎn)PIC為0.759，呈高度多態(tài)性，可能是該兔品種在長(zhǎng)期的選育過(guò)程中不同微衛(wèi)星座位所受選擇壓的差異所造成，也可能是由于選取的等位基因在不同家兔群體中的分布不均所導(dǎo)致。平均基因雜合度表示在被檢測(cè)位點(diǎn)上群體中雜合子的頻率，它是群體雜合程度的度量單位。群體平均基因雜合度的高低反映了群體遺傳一致性的程度，群體平均基因雜合度越低，反映該群體的遺傳一致性越高，也就是說(shuō)群體的遺傳變異越少，群體的遺傳多樣性越差。2個(gè)兔品種18個(gè)多態(tài)微衛(wèi)星標(biāo)記的基因雜合度在0.146～0.831之間變動(dòng)，其中福建黃兔的平均基因雜合度相對(duì)較高。多態(tài)信息含量、基因雜合度結(jié)果表明，在這2個(gè)家兔品種中，福建黃兔可提供的遺傳信息比新西蘭白兔相對(duì)要高，這很可能與其所處的獨(dú)特地理位置和特定的繁育方式有關(guān)，福建黃兔是由福州地區(qū)農(nóng)民長(zhǎng)期自繁自養(yǎng)形成的，后受到外來(lái)大型品種兔的沖擊，僅在邊遠(yuǎn)山區(qū)僅存少量純種。最終由福建省農(nóng)科院通過(guò)群體繼代選育得以保存[7]。

新西蘭白兔、福建黃兔是我國(guó)應(yīng)用較為廣泛的家兔品種資源，數(shù)量較多的等位基因和豐富的遺傳多樣性已開始被收集和保護(hù)，正是我國(guó)開展家兔遺傳資源保護(hù)的目標(biāo)，研究結(jié)果提示新西蘭白兔和福建黃兔群體具備較大的選擇空間，可以為今后進(jìn)行品種選育提高、開發(fā)培育新品種等提供豐富的基礎(chǔ)材料和科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 陳民利，蔡月琴，陶 濤，等.微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)WHBE 兔封閉群、日本大耳白兔和新西蘭兔的遺傳分析[J].中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（9）：21-27.

[2] BARKER J S F， MOORE S S， Hetzel D J S， et al. Genetic diversity of Asian water buffalo （Bubalus bubalis） microsatellite variation and a comparison with protein coding loci[J]. Animal Genetics， 1997（28）：103-115.

[3] RICHARDSONZ. Mapping of rabbit microsatellit e markers using chromosom especific Libraties[J].Journal of Heredity， 2003，94：161-169.

[4] 謝喜平，陳巖峰，孫世坤，等. 福建黃兔微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多樣性分析[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008（3）：239-243.

[5] JOSEPH S， DAVID W R. Molecular Cloning：A Laboratory Manual（Third Edition）[M]. Cold Spring Harbor： CSHL Press， 2002.483-485.

[6] 張 蕾，石福岳，秦立志， 等.利用熒光多重PCR技術(shù)分析8個(gè)兔品種遺傳多樣性[J]，安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012，40（24）：12262-12266.

[7] 張愛華.淺談福建黃兔[J].畜牧獸醫(yī)雜志，2004（6）：41.