摘 要： 為了更準(zhǔn)確地測(cè)定茄果親本間的親緣關(guān)系，提高育種效率，RAPD分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛運(yùn)用于茄果親緣關(guān)系的研究中。本文綜述了RAPD技術(shù)的原理和特點(diǎn)、茄果親緣關(guān)系的試驗(yàn)方法以及聚類(lèi)分析法研究進(jìn)展，以利于人們對(duì)RAPD技術(shù)在茄果親緣關(guān)系研究中的應(yīng)用有更深入的了解。

關(guān)鍵詞： 茄果； RAPD； 親緣關(guān)系

茄果種質(zhì)資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系研究是開(kāi)展茄果遺傳改良、促進(jìn)茄果生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展的重要基礎(chǔ)工作。

茄果類(lèi)蔬菜的種質(zhì)資源極為豐富，種質(zhì)資源親緣關(guān)系研究是蔬菜育種工作的重要組成部分，而DNA分子水平上的遺傳多樣性更有助于闡明親緣關(guān)系和正確分類(lèi)。

隨著新的有效的分子標(biāo)記方法不斷涌現(xiàn)，包括RAPD標(biāo)記在內(nèi)的各種基因型鑒定手段被廣泛運(yùn)用于植物種類(lèi)研究中[1-2]。RAPD技術(shù)材料用量少，效率高，引物通用性和廣泛性強(qiáng)，能直接反映DNA水平上的差異，且不受季節(jié)和環(huán)境條件的限制，在茄果類(lèi)蔬菜品種親緣關(guān)系的研究中被廣泛應(yīng)用。

1 概 述

RAPD技術(shù)是Williams等[3]在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的新型分子標(biāo)記方法，采用人工合成的具有9～10個(gè)寡核苷酸的隨機(jī)引物， 進(jìn)行DNA擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠上電泳， 經(jīng)EB染色后檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性。將RAPD分子標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行分析，在DNA分子水平上為物種進(jìn)化和分類(lèi)提供了有力證據(jù)，對(duì)生物的品系（種）鑒別和起源演化方面的研究具有重要意義。

RAPD技術(shù)在引物足夠多的情況下可以檢測(cè)整個(gè)目標(biāo)基因組的DNA多態(tài)性，通過(guò)不同引物反應(yīng)基因組的遺傳多樣性，找到近緣種間的遺傳物質(zhì)差異，從而表達(dá)種質(zhì)間的遺傳差異，從基因水平上區(qū)分作物種間關(guān)系，明確鑒定其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，為茄果種質(zhì)親緣關(guān)系的確立提供科學(xué)依據(jù)。

韓永升等[4]采用RAPD技術(shù)對(duì)辣椒7個(gè)親本和6個(gè)雜交組合進(jìn)行遺傳差異和親緣關(guān)系的研究，經(jīng)聚類(lèi)分析，可把13個(gè)不同辣椒品系分為7個(gè)大類(lèi)。朱海山[5]等用RAPD技術(shù)檢測(cè)了27份番茄材料的遺傳多樣性，并對(duì)其進(jìn)行了聚類(lèi)分析，結(jié)果表明，供試品種被劃分為6大類(lèi)群，其分類(lèi)與形態(tài)學(xué)上的分類(lèi)基本一致。冉進(jìn)等[6]利用RAPD技術(shù)對(duì)來(lái)源于國(guó)內(nèi)外的53份參試茄子種質(zhì)分為5大類(lèi)群，其聚類(lèi)結(jié)果與傳統(tǒng)分類(lèi)并不完全一致，與地理分布沒(méi)有關(guān)系。

2 PCR-RAPD試驗(yàn)方法研究進(jìn)展

以提取的符合試驗(yàn)要求的DNA為模板，篩選出擴(kuò)增條帶清晰且多態(tài)性較好的引物用于RAPD-PCR擴(kuò)增，使用瓊脂糖電泳法測(cè)定，在紫外光下檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并拍照。

RAPD技術(shù)使用的引物較短，要求退火溫度較低，提高了引物和模板的配對(duì)幾率和隨機(jī)性，大大地提高了基因組分析的效率和多態(tài)性的檢出，但也會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記的穩(wěn)定性和可重復(fù)性差等缺點(diǎn)，因此RAPD試驗(yàn)條件的標(biāo)準(zhǔn)化十分重要。選擇合適的RAPD引物，建立相對(duì)穩(wěn)定的RAPD反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序是RAPD技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ)。

2.1 RAPD引物篩選

進(jìn)行RAPD試驗(yàn)時(shí)，隨機(jī)引物的正確選取對(duì)實(shí)現(xiàn)RAPD-PCR有效擴(kuò)增十分關(guān)鍵，應(yīng)選用多態(tài)性強(qiáng)、擴(kuò)增重復(fù)性好、條帶清晰且較多的引物。

李洪濤等[7]從上海申友公司生產(chǎn)的160個(gè)BS序列的隨機(jī)引物中篩選得到36個(gè)在PCR擴(kuò)增中多態(tài)性豐富的引物，從中選用了11個(gè)對(duì)27個(gè)供試材料進(jìn)行擴(kuò)增，全部得到了較豐富的多態(tài)性。Thul等[8]從40個(gè)RAPD隨機(jī)引物中篩選出27個(gè)用于22個(gè)辣椒品種的鑒定和物種特異性描述。陳學(xué)軍等[9]以辣椒屬5個(gè)栽培種的13份材料中形態(tài)差異較大的2個(gè)供試材料DNA為模板， 進(jìn)行RAPD隨機(jī)引物的篩選，從120個(gè)引物中篩選出擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性高的引物23個(gè)進(jìn)行RAPD分析。李晴等[10]從115條RAPD隨機(jī)引物中選出11條對(duì)37份辣椒材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 得到多態(tài)性條帶36條，以此分析辣椒遺傳多樣性和種質(zhì)親緣關(guān)系。Ince等[11]在RAPD-PCR反應(yīng)的基礎(chǔ)上利用2 760個(gè)RAPD分子標(biāo)記，分析了辣椒屬24個(gè)品種的親緣關(guān)系。

2.2 RAPD-PCR反應(yīng)體系

RAPD的基本反應(yīng)程序就是PCR反應(yīng)，模板DNA濃度、質(zhì)量、引物濃度、Mg2+濃度、TaqDNA聚合酶的種類(lèi)及濃度、反應(yīng)程序等均會(huì)影響RAPD擴(kuò)增結(jié)果，因而只有研究出最適反應(yīng)體系，才能獲得最理想的RAPD圖譜。

由于不同的生物、不同的引物對(duì)反應(yīng)體系的要求不同，在進(jìn)行RAPD研究時(shí)，首先參照基本的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物明顯的引物進(jìn)行反應(yīng)體系的優(yōu)化及其引物篩選，再進(jìn)行遺傳標(biāo)記或遺傳多樣性等研究。

目前，針對(duì)不同茄果所采用的反應(yīng)體系大同小異，應(yīng)注重DNA濃度、MgCl2濃度、dNTP、Taq酶、引物濃度等方面的優(yōu)化，以尋求最佳反應(yīng)體系。

2.2.1 反應(yīng)體系的選擇 進(jìn)行RAPD試驗(yàn)前，需要根據(jù)試驗(yàn)條件選擇適宜的RAPD反應(yīng)體系，即反應(yīng)體系是建立在多少體積上的，一般采用10 μL，20 μL，25 μL反應(yīng)體系。陳杰等[12]利用10 μL的反應(yīng)體系，57個(gè)RAPD引物標(biāo)記對(duì)16份茄子材料進(jìn)行遺傳親緣關(guān)系分析。張曉煜等[13]在進(jìn)行番茄種質(zhì)資源遺傳多樣性的試驗(yàn)時(shí)，采用20 μL的RAPD反應(yīng)體系。林清等[14]利用25 μL反應(yīng)體系的RAPD技術(shù)對(duì)不同來(lái)源、不同類(lèi)型的34份加工型辣椒種質(zhì)資源進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2.2.2 反應(yīng)體系的優(yōu)化 在前人的基礎(chǔ)上，對(duì)所選擇的反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，即比較篩選RAPD擴(kuò)增體系的各影響因素，建立RAPD-PCR反應(yīng)的最佳體系。

模板DNA濃度過(guò)低會(huì)導(dǎo)致擴(kuò)增結(jié)果不穩(wěn)定，過(guò)高則導(dǎo)致引物或dNTPs過(guò)早耗盡， 出現(xiàn)擴(kuò)增條帶不穩(wěn)定的現(xiàn)象。Mg2+是Taq 聚合酶的激活劑， Mg2+濃度過(guò)低時(shí)， 酶活力顯著降低， 酶會(huì)催化非特異的擴(kuò)增。Taq酶的活力與RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)和量密切相關(guān)，酶活力的有無(wú)、高低直接影響著擴(kuò)增結(jié)果，另外還應(yīng)考慮到酶的污染問(wèn)題。dNTPS濃度過(guò)高， 會(huì)導(dǎo)致聚合酶錯(cuò)誤地?fù)饺耄?濃度過(guò)低會(huì)影響合成效率。引物濃度隨模板DNA濃度而定， 引物濃度過(guò)低無(wú)法檢測(cè)出所有RAPD位點(diǎn)， 濃度過(guò)高會(huì)產(chǎn)生引物二聚體，還會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增的增加。

2.2.2.1 回歸分析的方法 PCR體系優(yōu)化采用二因子全實(shí)施和單個(gè)因子的試驗(yàn)，設(shè)置試驗(yàn)各因子的水平，采用λDNA建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)每次擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳進(jìn)行標(biāo)定，確定各處理擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量。采用逐步回歸分析的方法建立模型，對(duì)入選因子分別建立方程，最后對(duì)入選因子進(jìn)行優(yōu)化分析。張子學(xué)等[15]以辣椒為材料，采用回歸分析的方法對(duì)RAPD體系進(jìn)行優(yōu)化研究，得到20 μL體系中主要因子的優(yōu)化組合。

2.2.2.2 單因素多水平梯度試驗(yàn) 對(duì)RAPD試驗(yàn)中的不同反應(yīng)成分的濃度分別設(shè)置梯度，在對(duì)某一成分的梯度進(jìn)行篩選時(shí)，保持其他成分不變，調(diào)整ddH2O的用量，使總體積保持不變。通過(guò)RAPD擴(kuò)增條帶結(jié)果比較，得出試驗(yàn)最佳體系。吳雪霞等[16]通過(guò)單因素多水平梯度試驗(yàn)，比較篩選RAPD擴(kuò)增體系的各影響因素，建立了茄子RAPD-PCR的最佳反應(yīng)體系。

2.2.2.3 正交設(shè)計(jì)優(yōu)化 根據(jù)正交法對(duì)DNA模板濃度、 dNTPs、Mg2+濃度、引物濃度、TaqDNA聚合酶濃度5個(gè)因素設(shè)置濃度梯度，每個(gè)因素選定4個(gè)濃度水平，選用正交試驗(yàn)表L16（45）安排試驗(yàn)。試驗(yàn)為5因素，4水平試驗(yàn)，16個(gè)組合。通過(guò)分析試驗(yàn)的電泳圖譜，得出試驗(yàn)因子的最佳組合。宗憲春等[17]利用正交設(shè)計(jì)建立了辣椒基因組適用的簡(jiǎn)單、穩(wěn)定和重復(fù)性較好的RAPD-PCR反應(yīng)體系。

RAPD分析的穩(wěn)定性和重復(fù)性在實(shí)際應(yīng)用中存在一些問(wèn)題，因而優(yōu)化體系的建立十分重要?；貧w分析是通過(guò)數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析方法處理試驗(yàn)，得出試驗(yàn)要素之間的相關(guān)關(guān)系，以相關(guān)系數(shù)的大小來(lái)判斷因子之間的相關(guān)的程度，使試驗(yàn)結(jié)果數(shù)字化，更加客觀。單因素多水平梯度試驗(yàn)，對(duì)每個(gè)因素的最佳水平進(jìn)行摸索，需要進(jìn)行多次的梯度試驗(yàn)，過(guò)程繁瑣且不能兼顧到各因素間的交互作用。正交法設(shè)計(jì)，充分考慮RAPD-PCR反應(yīng)中每個(gè)因素同時(shí)變化對(duì)反應(yīng)的影響，通過(guò)1次試驗(yàn)就得到了最佳反應(yīng)體系，大大簡(jiǎn)化了試驗(yàn)過(guò)程，節(jié)省了時(shí)間，降低了試驗(yàn)成本。

3 聚類(lèi)分析方法研究進(jìn)展

PCR-RAPD擴(kuò)增結(jié)果一般采用聚類(lèi)分析。聚類(lèi)分析是直接比較各事物之間的性質(zhì)，將性質(zhì)相近的歸為一類(lèi)，將性質(zhì)差別較大的歸入不同的類(lèi)。在系統(tǒng)聚類(lèi)分析中，用戶(hù)事先無(wú)法確定類(lèi)別數(shù)，系統(tǒng)將所有例數(shù)均調(diào)入內(nèi)存，且可執(zhí)行不同的聚類(lèi)算法。系統(tǒng)聚類(lèi)分析有2種形式，一是對(duì)研究對(duì)象本身進(jìn)行分類(lèi)，稱(chēng)為Q型聚類(lèi)；另一是對(duì)研究對(duì)象的觀察指標(biāo)進(jìn)行分類(lèi)，稱(chēng)為R型聚類(lèi)。

聚類(lèi)結(jié)果可以初步反映各材料之間的遺傳關(guān)系遠(yuǎn)近，建立親緣關(guān)系圖，從而得出茄果的親緣關(guān)系。

3.1 NTSYS軟件分析法

擴(kuò)增結(jié)果采用二元性編碼，把某一條帶的有無(wú)2種狀態(tài)即每個(gè)RAPD擴(kuò)增的條帶記錄為1個(gè)遺傳位點(diǎn)，將同一引物、同一位點(diǎn)，有DNA擴(kuò)增帶記為1，無(wú)帶記為0，形成1/0矩陣。

試驗(yàn)的相似系數(shù)采用Nei和Li的公式：Sij=2a/[（a+b）+（a+c）]，公式中Sij代表2個(gè)材料i和j之間的相似系數(shù)，a為2個(gè)材料共用的條帶數(shù)，b為材料i有而j沒(méi)有的條帶數(shù)，c為材料j有而i沒(méi)有的條帶數(shù)。GD（遺傳距離）=1-GS（遺傳相似系數(shù)），利用NTSYS軟件進(jìn)行Nei-Li遺傳相異系數(shù)分析，用SAHN（sequential，agglomerative，hierarchical and nested clustering）功能，按照非加權(quán)配對(duì)算數(shù)平均法UPGMA法（unweighted pairgroup method and arithetic average）進(jìn)行聚類(lèi)分析，再用Tree Display功能繪出聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖。

陳學(xué)軍等[18]應(yīng)用NTSYS軟件進(jìn)行遺傳相似系數(shù)和聚類(lèi)分析，得到31個(gè)辣椒品種的親緣關(guān)系樹(shù)狀圖。

3.2 SPSS軟件分析法

用Quantity One一維凝膠分析軟件自動(dòng)讀取RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物，有條帶的記為1，無(wú)條帶的記為0，系統(tǒng)自動(dòng)生成1與0形式的報(bào)告單。

將報(bào)告結(jié)果錄入POPGENE 1.31，計(jì)算RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)位點(diǎn)數(shù)（number of polymorphic loci）、多態(tài)位點(diǎn)比例（percentage of polymorphic loci）、Shannon多樣性指數(shù)、Nei’s指數(shù)、每位點(diǎn)有效等位基因數(shù)（effective number of alleles，NE）、遺傳離散度（Ht）和遺傳分化系數(shù)（Gst）。利用SPSS11.0分析軟件中的Jaccard法和Within-group linkage進(jìn)行聚類(lèi)分析，以Fartherest neighber聚類(lèi)分析方法計(jì)算并建立親緣關(guān)系樹(shù)狀圖。

王秋錦等[19]用SPSS 11.0分析軟件對(duì)34份茄子的RAPD擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類(lèi)分析，從分子水平上檢測(cè)了茄子的遺傳多樣性。

3.3 DPS軟件分析法

對(duì)RAPD標(biāo)記數(shù)據(jù)進(jìn)行二元性編碼，形成0，1矩陣。采用DPS 7.05軟件進(jìn)行Nei-Li相異系數(shù)分析，根據(jù)遺傳相異系數(shù)矩陣，通過(guò)非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類(lèi)分析，建立自交系材料親緣關(guān)系圖。

溫慶放等[20]對(duì)32個(gè)櫻桃番茄品種進(jìn)行RAPD 分析，運(yùn)用DPS軟件生成聚類(lèi)圖，從而對(duì)遺傳多樣性和分類(lèi)進(jìn)行探討和研究。

4 問(wèn)題及展望

RAPD-PCR的擴(kuò)增能力很強(qiáng)，即使反應(yīng)混合物中只含有1個(gè)拷貝的靶DNA分子，也能被有效擴(kuò)增，所以任何DNA樣品或試驗(yàn)試劑均應(yīng)仔細(xì)避免發(fā)生被污染的可能性，同時(shí)也意味著分子生物學(xué)分析現(xiàn)在已經(jīng)可以應(yīng)用于只含有痕量DNA的樣品。

就目前RAPD標(biāo)記研究現(xiàn)狀來(lái)說(shuō)，其可靠性已基本上得到了肯定。但在應(yīng)用上還是有不少問(wèn)題出現(xiàn)，如前后試驗(yàn)結(jié)果不一致、不同人之間的結(jié)果不能比較等。這些往往是由于前后試驗(yàn)，不同人之間采用了不同反應(yīng)條件所引起的。

不容忽視的是，RAPD 標(biāo)記是1個(gè)顯性標(biāo)記，存在共遷徙問(wèn)題，試驗(yàn)穩(wěn)定性和重復(fù)性較差。而且，由于RAPD技術(shù)應(yīng)用費(fèi)用昂貴，試驗(yàn)條件要求高，國(guó)內(nèi)農(nóng)業(yè)科技工作者對(duì)它們的認(rèn)識(shí)掌握局限等因素，還沒(méi)有被多數(shù)科研單位和科研人員運(yùn)用，僅局限在設(shè)備條件較好的少數(shù)單位。盡管RAPD的再現(xiàn)性備受爭(zhēng)議，RAPD標(biāo)記仍被廣泛應(yīng)用于植物和動(dòng)物的DNA指紋識(shí)別和圖譜學(xué)習(xí)[21-22]。

利用RAPD擴(kuò)增體系對(duì)茄果種質(zhì)資源進(jìn)行分類(lèi)和品種鑒定，得出的親緣關(guān)系是較為可靠的，這是由于RAPD分類(lèi)的依據(jù)是以DNA模扳擴(kuò)增的多態(tài)性DNA片斷進(jìn)行聚類(lèi)分析的結(jié)果，而不是形態(tài)特征或表現(xiàn)形式的分類(lèi)?？梢灶A(yù)見(jiàn)， RAPD技術(shù)在不久的將來(lái)會(huì)在植物親緣關(guān)系研究中發(fā)揮更大作用。

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