[摘要]目的：探討非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤糖蛋白B（glycoprotein （transmembrane） nonmetastatic melanoma protein b，GPNMB）與酪氨酸酶（tyrosinase）的相互作用。方法：以黑素細胞系PIG1為研究對象，分別構(gòu)建GPNMB和Tyr的siRNA以及過表達載體，轉(zhuǎn)染入細胞后采用實時定量RT-PCR、Western blot檢測GPNMB表達下調(diào)和上調(diào)對Tyr的影響，以及Tyr表達下調(diào)和上調(diào)對GPNMB的影響；采用免疫共沉淀法檢測它們之間的直接相互作用。結(jié)果：GPNMB表達下調(diào)和上調(diào)對Tyr有影響，而Tyr表達下調(diào)和上調(diào)對GPNMB幾乎沒有影響。結(jié)論：黑素細胞中GPNMB與Tyr之間不存在直接相互作用，為進一步研究GPNMB在黑素小體形成中的作用機制奠定了基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]黑素小體；黑素細胞；非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤糖蛋白B；酪氨酸酶

[中圖分類號]R329.2 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）04-0459-05

黑素細胞是一種皮膚里的特殊細胞，它可以產(chǎn)生黑色素，防止陽光對人體皮膚的輻射導致的細胞染色體受損。黑素小體是黑素細胞特有的膜性細胞器，是合成和儲存黑色素的亞細胞結(jié)構(gòu)，它的形成按其成熟程度不同可分成四個時期：I期黑素小體即前黑素小體，它含有很多低電子密度的囊泡；Ⅱ期黑素小體呈橢球形，內(nèi)有沿長軸平行排列的纖維絲；Ⅲ期黑素小體其內(nèi)部纖維絲上沉積著黑色素；Ⅳ期黑素小體其纖維絲被黑色素完全掩蓋[1]。黑素小體生成或轉(zhuǎn)運異常與色素相關(guān)疾病的發(fā)病機理有著密切聯(lián)系，如白化病、白癜風等?，F(xiàn)普遍認為Tyr在黑素小體的生成中起著重要調(diào)控作用[2-4]。GPNMB是一種細胞表面蛋白多糖。同時，它也是一種黑素小體特異性結(jié)構(gòu)蛋白[1]，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，它在黑素小體的形成過程中也起著重要作用。GPNMB被siRNA基因沉默后，黑素小體的形成受到抑制，同時，Tyr的表達量顯著下降[5]。雖然，Tyr表達量的變化會影響黑素小體的形成[2]，但它對GPNMB的表達有無影響，目前尚不清楚。因此，本研究擬探討GPNMB與Tyr之間的相互作用，為深入了解GPNMB在黑素小體形成中的作用機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞：人來源的傳代穩(wěn)定的黑色素細胞系PIG1，由芝加哥洛約拉大學Caroline Le Poole 教授惠贈。

1.1.2 主要儀器及試劑：CO2細胞培養(yǎng)箱（Binder，德國），JEM-1200EX型透射電子顯微鏡（JEOL，日本），Bio-Rad iQ5實時定量PCR儀（Bio-Rad公司，美國），CellTiter-BlueR Cell Viability Assay試劑盒（Promega，美國），BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)研究所，南通），ECL化學發(fā)光試劑盒（Boehringer Mannheim，德國），RNAiso plus kit、PrimeScriptR RT reagent kit、SYBRR Premix Ex TaqTM II kit，限制性內(nèi)切酶EcoRI、XhoI，T4連接酶（Takara，大連），Lipofectam ineTM RNAiMAX（Invitrogen，美國），抗酪氨酸酶抗體、抗β-肌動蛋白抗體、辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG （北京博奧森生物技術(shù)有限公司，北京），載體pMD19-T、pcDNA3.1（+），PE（Phycoerythrin）偶聯(lián)的羊抗兔IgG（Invitrogen，美國），抗GPNMB抗體（Abcam，美國），M254培養(yǎng)基、胎牛血清（FCS）、S-002添加劑（GIBCO BRL，美國）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及收集裂解細胞：培養(yǎng)PIG1細胞系，培養(yǎng)環(huán)境：M254細胞培養(yǎng)液（內(nèi)含5%胎牛血清及S-002添加劑），5%CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱。吸收培養(yǎng)基，加入PBS將細胞吹起后收集細胞，用裂解緩沖液重懸細胞，冰上放置30min，離心去沉淀，上清液用于免疫共沉淀實驗。

1.2.2 RNA的提取與實時定量RT-PCR：采用RNAiso plus kit試劑盒提取PIG1細胞中的總RNA，按照試劑盒要求操作。按實驗室常規(guī)方法進行PCR擴增。定量PCR采用的體系為：dNTPs 2μl，10×buffer 5μl，上下游引物各10pmol，Pfu酶0.5μl，模板2μl，加三蒸水至總體積50μl；擴增條件為：預變性94℃ 5min，進入循環(huán)，變性94℃ 1min，退火60℃ 1min，延伸72℃ 3min，30個循環(huán)后，72℃延伸5 min。

以β-actin為內(nèi)參，依據(jù)2-ΔΔCT法[6]計算各樣本mRNA的相對表達量。

1.2.3 表達載體的構(gòu)建：將以GPNMB-P3、GPNMB-P4為引物擴增的GPNMB目的片段，與pMD19-T載體在16℃條件下進行連接反應，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于感受態(tài)大腸桿菌DH5α，培養(yǎng)后進行篩選，挑選陽性菌落搖菌并提取質(zhì)粒，電泳鑒定后獲得重組質(zhì)粒pMD19T-GPNMB。以重組質(zhì)粒為模板，以GPNMB-P5、GPNMB-P6為引物，擴增GPNMB編碼區(qū)序列，擴增產(chǎn)物以EcoRI、XhoI雙酶切，并用T4 DNA連接酶將其與真核表達載體pcDNA3.1（+）連接，獲得重組表達載體pcDNA3.1（+）-GPNMB。Tyr表達載體的構(gòu)建方法與之相同。

1.2.4 Western blot：每個樣品取40μg蛋白進行常規(guī)SDS-PAGE電泳，蛋白濃度采用BCA試劑盒測定。采用Western blot法分析蛋白表達水平[5]。

1.2.5 轉(zhuǎn)染：按5×104/孔接種PIG1細胞至24孔培養(yǎng)板中，待其長至50%融合時進行轉(zhuǎn)染。具體方法：加入100μl無血清M254培養(yǎng)基（內(nèi)含siRNA 6pmol，Lipofectamine 1μl），混勻后于5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育。24h后采用Western blot檢測各組的轉(zhuǎn)染效率。以FAM-siRNA作為陰性對照。

1.2.6 細胞生存能力測定：采用CellTiter 96R AQueous One Solution Cell Proliferation Assay Kit試劑盒測定細胞生存能力，具體操作按照說明書進行。

1.2.7 透射電鏡：常規(guī)方法制備經(jīng)不同處理后的PIG1細胞樣品，置于透射電鏡下觀察黑素小體的形成。

1.2.8 免疫共沉淀：向1.2.1收集到的上清液中加入抗GPNMB抗體或抗Tyr抗體，4℃混勻2h，加入Agrose Plus A 40μl，4℃混勻8h，混合物于4℃離心5min，用預冷的裂解緩沖液輕輕重懸磁珠，離心洗滌3次，沉淀中加入50μl上樣緩沖液（輕彈混勻），沸水浴5min，離心后收集上清。再對這些蛋白經(jīng)SDS-PAGE，Western blot來檢測GPNMB和Tyr相互作用，以IgG1作為對照組。

1.2.9 統(tǒng)計分析：采用t檢驗分析，以SPSS11.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計，組間比較采用方差分析，P<0.05代表差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GPNMB影響黑色素小體的形成：采用免疫印跡法測定GPNMB的蛋白表達水平。結(jié)果（見圖1）顯示，F(xiàn)AM-siRNA和空載體組的GPNMB表達量較對照組無明顯變化，而GPNMB-siRNA組表達水平明顯降低（*P<0.05），GPNMB過表達組表達水平則顯著增強（*P<0.05）。為了更清楚地了解PIG1細胞中黑素小體的數(shù)目和形態(tài)，我們使用透射電鏡對各組標本進行觀察，結(jié)果（見圖2）顯示，對照組PIG1細胞本身就有一定數(shù)目的早期黑素體和極少數(shù)成熟黑素體（圖2A），F(xiàn)AM-siRNA組和空載體組無明顯變化（圖2B、D），而GPNMB-siRNA轉(zhuǎn)染組黑素小體數(shù)量急劇下降，在大多數(shù)細胞中僅能看到極少數(shù)早期黑素體（圖2C），GPNMB過表達組黑素小體數(shù)量明顯增多（圖2E）。該結(jié)果表明GPNMB-siRNA轉(zhuǎn)染可以顯著抑制黑素小體的形成，而GPNMB過表達則會促進黑素小體的形成。為了排除轉(zhuǎn)染對細胞生存能力的影響，我們對轉(zhuǎn)染后細胞的生存能力進行了測定。結(jié)果（見圖3）顯示，與對照組相比，siRNA轉(zhuǎn)染和表達載體轉(zhuǎn)染對PIG1細胞的生存能力均無顯著影響。

2.2 GPNMB-siRNA以及過表達對Tyr的影響：“2.1”結(jié)果表明GPNMB在黑素小體形成中起著重要作用，而Tyr一直被認為是影響黑素小體形成的關(guān)鍵酶。為了研究它們之間的相互作用，我們采用實時定量RT-PCR、免疫印跡法檢測GPNMB對Tyr表達的影響。結(jié)果（見圖4）顯示，F(xiàn)AM-siRNA組和空載體組Tyr的mRNA及蛋白表達水平較對照組無顯著變化，而GPNMB-siRNA組Tyr的mRNA及蛋白表達水平均明顯下降（*P<0.05），但其減少量有所不同；GPNMB過表達組的mRNA及蛋白表達量均明顯增加（*P<0.05），其增加量不相同。該結(jié)果說明GPNMB對Tyr的表達有直接影響。

2.3 Tyr-siRNA以及過表達對GPNMB的影響：實驗表明GPNMB對Tyr的表達有直接影響，反之，Tyr對GPNMB有無影響，尚不清楚。為了研究Tyr對GPNMB的影響，我們采用免疫印跡法進行檢測。結(jié)果（見圖5）顯示，F(xiàn)AM-siRNA組和空載體組Tyr和GPNMB的蛋白表達量均無變化，Tyr-siRNA組Tyr的蛋白表達水平顯著下降（*P<0.05），而GPNMB的表達只有少量降低；Tyr過表達組Tyr的蛋白表達水平明顯上升（*P<0.05），而GPNMB的表達量有微弱增加。該結(jié)果說明Tyr對GPNMB的表達幾乎沒有影響。

2.4 免疫共沉淀：為了進一步證實PIG1細胞中GPNMB和Tyr的相互作用，我們按經(jīng)典方法進行了免疫共沉淀試驗。結(jié)果（見圖6）所示，用抗GPNMB單抗沉淀后用抗Tyr單抗未能檢測出Tyr，同時用抗GPNMB單抗能檢測出GPNMB的存在；用抗Tyr單抗沉淀后用抗GPNMB單抗未能檢測出GPNMB，同時用抗Tyr單抗能檢測出Tyr的存在。此結(jié)果表明，GPNMB和Tyr之間無直接相互作用。

3 討論

Tyr作為黑素小體中一種特異蛋白，可調(diào)節(jié)黑色素的合成，其異常過量表達可導致人體色素沉著性疾病的發(fā)生[7-8]。目前對于色素沉著性疾病的研究主要在Tyr作用機制以及尋找抑制Tyr活性分子等方面[9-11]，雖然關(guān)于Tyr作用機制的研究已較為深入，但是對參與其中的調(diào)控基因及其信號傳導機制還未完全清楚。因此尋找與Tyr相互作用的蛋白，對于弄清Tyr到底通過何種途徑影響黑素小體的形成有著重要意義。

GPNMB是一種多糖基化的跨膜蛋白。文獻報道，它可調(diào)控黑素小體的形成，同時也是黑素小體特異性蛋白[5，12]。本實驗采用透射電鏡觀察經(jīng)處理的各組標本，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GPNMB-siRNA組黑素小體數(shù)量急劇下降，而GPNMB過表達組黑素小體數(shù)量明顯增多，這表明GPNMB在黑素小體的形成中起著重要作用。而Tyr也是黑素小體形成中的一種必需分子，由于GPNMB與Tyr相互作用的研究還未見報到，為了探討二者之間的相互作用，我們分別構(gòu)建了GPNMB和Tyr的siRNA以及過表達載體，采用轉(zhuǎn)染的方法將其轉(zhuǎn)入細胞，然后采用實時定量RT-PCR、Western blot檢測GPNMB表達下調(diào)和上調(diào)對Tyr的影響，以及Tyr表達下調(diào)和上調(diào)對GPNMB的影響。結(jié)果表明GPNMB-siRNA可以顯著降低Tyr的表達水平，而GPNMB過表達則會顯著上調(diào)Tyr的表達水平；反之，Tyr-siRNA或過表達基本不會影響GPNMB的表達水平，由此我們推斷二者之間無直接的相互作用。免疫共沉淀法是目前常用的檢測蛋白相互作用的方法，該實驗驗證了我們的推斷，結(jié)果表明GPNMB與Tyr之間無直接相互作用。結(jié)合二者在黑素小體的形成中都起著重要作用，我們推測GPNMB可能是位于Tyr上游的一個關(guān)鍵調(diào)節(jié)靶點，它對Tyr的調(diào)節(jié)并不限于轉(zhuǎn)錄水平，可能還有其它蛋白的參與，或者激活了已有的無活性的酪氨酸酶，進而調(diào)控黑素小體的形成，它在黑素小體形成中的作用機制還有待于進一步研究。

[參考文獻]

[1]Hoashi T， Sato S， Yamaguchi Y， et al. Glycoprotein nonmetastatic melanoma protein b， a melanocytic cell marker， is a melanosom-specific and proteolytically released protein[J]. FASEB J， 2010， 24（5）： 1616-1629.

[2]An SM， Koh JS， Boo YC， et al. Inhibition of melanogenesis by tyrosinase siRNA in human melanocytes[J]. BMB Reports， 2009， 42： 178-183.

[3]Orlow SJ， Silvers WK， Zhou BK， et al. Comparative decrease in tyrosinase， TRP-1，TRP-2， and Prel 17/silver antigenic proteins from melanotic to amelanotic stages of syngeneic mouse cutaneous and metastases[J]. Cancer Res， 1998， 58（7）： 1521-1523.

[4]Jimbow K， Park JS， Kato F， et al. Assembly， target-signaling and intracellular transport of tyrosinase gene family proteins in the initial stage of melanosome biogenesis[J]. Pigment Cell Res， 2000， 13： 222-229.

[5]Zhang P， Liu W， Zhu CS， et al. Silencing of GPNMB by siRNA Inhibits the Formation of Melanosomes in Melanocytes in a MITF-Independent Fashion[J]. PLOS ONE， 2012，7：e42955.

[6]Livak KJ， Schmittgen TD. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2（-Delta Delta C（T）） Method[J]. Methods， 2001， 25（4）： 402-408.

[7]Briganti S， Camera E， Picardo M， et al. Chemical and instrumental approaches to treat hyperpigmentation[J]. Pigment Cell Res， 2003， 16（2）： 101-110.

[8]Victor FC， Gelber J， Rao B. Melasma： a review[J]. J. Cutan. Med. Surg， 2004， 8（2）： 97-102.

[9]Boissy RE， Visscher M， Delong MA. DeoxyArbutin： a novel reversible tyrosinase inhibitor with effective in vivo skin lightening potency[J]. Exp Dermatol， 2005， 14： 601-608.

[10]Kim YJ， Uyama H. Tyrosinase inhibitors from natural and synthetic sources： structure， inhibition mechanism and perspective for the future[J]. Cell Mol Life Sci， 2005， 6： 1707-1723.

[11]Xie JJ， Song KK， Qiu L， et al. Inhibitory effects of substrate analogs on enzyme activity and substrate specificities of mushroom tryosinase[J]. Food Chem， 2007， 103： 1075-1079.

[12]Tomihari M， Hwang SH， Chung JS， et al. Gpnmb is a melanosome- associated glycoprotein that contributes to melanocyte/keratinocyte adhesion in a RGD-dependent fashion[J]. Exp Dermatol， 2009， 18： 586-595.

[收稿日期]2012-11-13 [修回日期]2013-02-20

編輯/張惠娟