董玉娟，李素梅，周敏

廣東省第二中醫(yī)院，廣東 廣州 510095

柔肝方由鉤藤、天麻、白芍、川牛膝等七味中藥組方而成，是廣東省第二中醫(yī)院心血管科專家多年來總結(jié)的臨床驗(yàn)方。本方具有平肝柔肝功效，臨床研究表明可明顯改善高血壓肝陽上亢癥患者的頭痛、頭暈、頭脹等不適癥狀，且可有效降低患者血壓、血漿腎素及血管緊張素Ⅱ水平［1-2］。為了減少中藥煎煮煩瑣，保證用藥質(zhì)量，推進(jìn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化，已將其開發(fā)為使用方便的顆粒劑。本課題采用薄層色譜法與高效液相色譜法二者結(jié)合來為保證柔肝顆粒質(zhì)量提供方法學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

微量分析天平（Mettler-Toledo XPE26）；電子分析天平（Mettler-Toledo ME55）；電熱數(shù)恒溫水浴鍋（HH-2 LICHEN）；數(shù)控超聲波清洗機(jī)（KQ-50E昆山）；薄層自動(dòng)點(diǎn)樣器（CAMAG AUTOMATIC TLC SAMPLER 4）；高效液相色譜儀（Agilent 1100）；Agilent Extend-C18 液相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；自動(dòng)純水機(jī)（MilliPore Advantage A10）。

1.2 藥品與試劑

芍藥苷對(duì)照品（批號(hào)：110736-201640，純度為95.2%）；鉤藤對(duì)照藥材（批號(hào)：121190-201204）；白芍對(duì)照藥材（批號(hào)：120905-201610）；川牛膝對(duì)照藥材（批號(hào)：121065-201406）均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。柔肝顆粒（批號(hào)：20200506、20200507、20200508，規(guī)格：每袋裝6 g，每袋相當(dāng)于飲片23.35 g）來源于廣東省第二中醫(yī)院制劑室。柔肝顆粒陰性對(duì)照所用藥材均為廣州至信藥業(yè)股份有限公司購(gòu)買并經(jīng)鑒定符合《中國(guó)藥典》中各藥材標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 的定性鑒別

2.1.1 鉤藤（1）供試品溶液制備：三個(gè)批號(hào)樣品分別取樣2 g，研缽研細(xì)，加入2 mL 濃氨試液，樣品浸泡30 min 后加入50 mL 三氯甲烷，置水浴鍋中加熱回流2 h，取20 mL 濾液蒸干，殘?jiān)? mL 甲醇溶解殘?jiān)吹?。?）對(duì)照藥材溶液制備：取鉤藤對(duì)照藥材1 g，同（1）法制備。（3）陰性對(duì)照溶液制備：按柔肝顆粒處方比例，取除鉤藤以外六味中藥參照工藝制法進(jìn)行水煮、濃縮、干燥等步驟制得陰性對(duì)照溶液，取樣2 g，同（1）法制備。自動(dòng)點(diǎn)樣器精密吸?。?）（2）（3）溶液點(diǎn)于硅膠G 薄層板上，展開缸里展開，展開劑：石油醚（60～90 ℃）-丙酮（6∶4），顯色劑：改良碘化鉍鉀試液。由圖1 可見：三個(gè)批號(hào)樣品的色譜圖基本一致，表明本制劑生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，且供試品的色譜圖與對(duì)照藥材的色譜圖在相同位置上有相同的黃色斑點(diǎn)，該黃色斑點(diǎn)在陰性對(duì)照色譜圖中未出現(xiàn)。

圖1 鉤藤的薄層色譜圖

2.1.2 川牛膝（1）供試品溶液制備：三個(gè)批號(hào)樣品分別取樣4 g，研缽研細(xì)后置具塞錐形瓶中，加入甲醇50 mL，置于數(shù)控超聲波清洗機(jī)中進(jìn)行超聲處理30 min，取濾液蒸干，殘?jiān)?0 mL 水溶解，水溶液用50 mL 水飽和正丁醇分次進(jìn)行萃取，得正丁醇萃取液，用氨試液分次洗滌，棄去，蒸干正丁醇液并加1 mL 甲醇溶解即得。（2）對(duì)照藥材溶液制備：取1 g 川牛膝對(duì)照藥材，同（1）法制備。（3）陰性對(duì)照溶液制備：按柔肝顆粒處方比例，取除川牛膝以外六味中藥，參照工藝制法進(jìn)行水煮、濃縮、干燥等步驟制得陰性對(duì)照溶液，取樣4 g，同（1）法制備。自動(dòng)點(diǎn)樣器精密吸?。?）（2）（3）溶液點(diǎn)于硅膠G薄層板上，放置于展開缸中展開，展開劑：三氯甲烷-甲醇-甲酸（9∶1∶0.5），顯色劑：1%對(duì)二甲氨基苯甲醛10%硫酸乙醇溶液，60 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，放置于紫外光燈365 nm 下進(jìn)行檢視。結(jié)果顯示：三個(gè)批號(hào)樣品的色譜圖基本一致，且在與對(duì)照藥材色譜圖中相同位置上均有相同的顏色熒光斑點(diǎn)，該熒光斑點(diǎn)在陰性對(duì)照色譜圖中未出現(xiàn)。見圖2。

圖2 川牛膝的薄層色譜圖

2.1.3 白芍（1）供試品溶液制備：三個(gè)批號(hào)樣品分別取樣1 g，研缽研細(xì)，加入25 mL 乙醇進(jìn)行超聲處理30 min，取濾液蒸干，加1 mL 乙醇溶解殘?jiān)吹谩＃?）對(duì)照藥材溶液制備：取白芍對(duì)照藥材0.5 g，同（1）法制備。（3）陰性對(duì)照溶液制備：按柔肝顆粒處方比例，取除白芍以外六味中藥參照工藝制法進(jìn)行水煮、濃縮、干燥等步驟制得陰性對(duì)照溶液，取樣1 g，同（1）法制備。自動(dòng)點(diǎn)樣器精密吸?。?）（2）（3）溶液點(diǎn)于硅膠G 薄層板上進(jìn)行展開，展開劑：三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯（8∶4∶1），氨蒸氣預(yù)飽和，顯色劑：5%香草醛硫酸溶液加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。結(jié)果顯示：三個(gè)批號(hào)樣品的色譜圖基本一致，且均有相同的藍(lán)紫色斑點(diǎn)與對(duì)照藥材色譜圖的對(duì)應(yīng)位置一致，在陰性對(duì)照色譜圖中未見該藍(lán)紫色斑點(diǎn)。見圖3。

圖3 白芍的薄層色譜圖

2.2 高效液相色譜的定量分析

2.2.1 溶液的制備供試品溶液的制備：取已研細(xì)的柔肝顆粒樣品約0.5 g，置于50 mL 具塞錐形瓶中精密稱定，精密加入25 mL 稀乙醇，稱定重量，超聲處理30 min 后，取出放冷，待其冷卻后再稱重，用稀乙醇補(bǔ)重后取續(xù)濾液進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備：精密稱定芍藥苷對(duì)照品2.647 mg，置于25 mL 容量瓶中，加甲醇溶解至刻度搖勻制成100.8 μg/mL 的溶液。陰性對(duì)照溶液的制備：按柔肝顆粒處方比例，取除白芍以外六味中藥參照工藝制法進(jìn)行水煮、濃縮、干燥等步驟制得陰性對(duì)照，取已研細(xì)的陰性對(duì)照0.5 g，精密稱定，同法制得。

2.2.2 色譜條件液相色譜柱：Agilent Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸溶液（15∶85），檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm，柱溫：25 ℃，流速：1 mL/min，進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.3 測(cè)定法分別精密吸取上述“2.2.1”項(xiàng)中的三種溶液注入高效液相色譜儀中進(jìn)行測(cè)定，在供試品溶液的HPLC 色譜圖中可找到與對(duì)照品芍藥苷一致的色譜峰，且在陰性對(duì)照的色譜圖中未出現(xiàn)該色譜峰。見圖4。

圖4 高效液相色譜圖：A.芍藥苷對(duì)照品；B.供試品；C.陰性樣品

2.2.4 方法學(xué)考察（1）線性關(guān)系考察：取芍藥苷對(duì)照品溶液（100.8 μg/mL）加甲醇稀釋制成分別為10.08 μg/mL、20.16 μg/mL、30.24 μg/mL、50.40 μg/mL、70.56 μg/mL、100.80 μg/mL 6 種不同濃度的溶液。精密吸取6 種不同濃度的對(duì)照品溶液各10 μL 進(jìn)行檢測(cè)，橫坐標(biāo)為芍藥苷進(jìn)樣量，縱坐標(biāo)為芍藥苷峰面積，得回歸方程：Y=3 132.8X+51.719（r=0.999 9），表明在0.100 8～1.008 μg 范圍內(nèi)芍藥苷呈良好線性回歸。（2）精密度試驗(yàn)：同一供試品溶液連續(xù)進(jìn)樣檢測(cè)6 次，計(jì)算6 次所得芍藥苷峰面積的RSD 為0.46%，表明所用HPLC 儀器精密度良好。（3）重復(fù)性試驗(yàn)：分別精密稱取6 份供試品，制備供試品溶液，進(jìn)樣檢測(cè)，6 份供試品溶液中芍藥苷含量的RSD 計(jì)算結(jié)果為0.58%，表明所建立的HPLC 含量檢測(cè)方法重現(xiàn)性良好。（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)：同一供試品溶液分別于0、2、4、8、12 h 進(jìn)樣檢測(cè)，5 次所得芍藥苷峰面積的RSD 計(jì)算結(jié)果為0.21%，表明在12 h 內(nèi)樣品溶液穩(wěn)定，保證檢測(cè)結(jié)果可靠。（5）加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已知芍藥苷含量的供試品9 份，分別按80%、100%、120%加入芍藥苷對(duì)照品各3 份，制備供試品溶液，檢測(cè)，計(jì)算得回收率為98.56%，RSD 為1.04%。

2.2.5 供試品含量測(cè)定分別稱取3 個(gè)批號(hào)（20200506、20200507、20200508）柔肝顆粒樣品0.5 g，精密稱定，各2 份，制備供試品溶液，計(jì)算得柔肝顆粒中芍藥苷的含量分別為：4.972 6 mg/g、4.753 7 mg/g、4.831 7 mg/g，平均含量為4.852 7 mg/g。以平均含量80%設(shè)限，擬定每袋制劑中芍藥苷的含量不少于23.29 mg。

3 討論

柔肝顆粒由鉤藤、天麻、白芍、川牛膝、桑寄生、杜仲、茯苓七味中藥經(jīng)水提、濃縮、干燥、制粒等步驟制備而成。方中鉤藤長(zhǎng)于清肝熱，天麻息風(fēng)止痙，平抑肝陽，二者用以為君藥而達(dá)平肝祛風(fēng)功效；白芍養(yǎng)血柔肝、川牛膝味苦善泄降而引血下行，二者相配以為臣，火氣無從上擾，養(yǎng)陰瀉火相得益彰；桑寄生、杜仲補(bǔ)肝腎以固本，茯苓健脾利水以安中焦脾胃，三藥共奏柔肝益腎，寧心安神之功，為佐藥。目前柔肝顆粒只根據(jù)《中國(guó)藥典》顆粒劑檢查項(xiàng)下的粒度、水分、溶化性等進(jìn)行質(zhì)量控制，無針對(duì)本方所含的藥材與有效成分進(jìn)行檢測(cè)。由于缺乏系統(tǒng)化標(biāo)準(zhǔn)化的質(zhì)量評(píng)價(jià)且檢測(cè)指標(biāo)較少、檢測(cè)手段較低，中藥制劑質(zhì)量良莠不齊，質(zhì)量可控性較差難以保證有效性，臨床使用反饋療效不穩(wěn)定為醫(yī)院制劑存在的主要問題之一［3-5］。為了有效地控制柔肝顆粒制劑的質(zhì)量，本試驗(yàn)采用TLC 薄層色譜與HPLC含量測(cè)定來制定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。

本試驗(yàn)采用TLC 定性鑒別方法進(jìn)行鑒別君藥和臣藥，結(jié)果提示天麻色譜圖陰性有干擾；鉤藤、白芍的色譜方法均在《中國(guó)藥典》的基礎(chǔ)上進(jìn)行調(diào)整，分離度較好、無拖尾、斑點(diǎn)清晰、陰性無干擾；川牛膝參照《中國(guó)藥典》方法進(jìn)行鑒別時(shí)，斑點(diǎn)分離度差，拖尾嚴(yán)重，在參考文獻(xiàn)［6］的基礎(chǔ)上再做調(diào)整后，結(jié)果理想。鉤藤、白芍、川牛膝的鑒別方法簡(jiǎn)便、可操作性強(qiáng)，故選擇上述藥材作為本制劑的快速定性鑒別方法的指標(biāo)。在建立含量測(cè)定方法時(shí)，應(yīng)選擇君藥為含量測(cè)定指標(biāo)，在參考《中國(guó)藥典》與文獻(xiàn)［7-9］對(duì)鉤藤堿與天麻素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，陰性均有干擾，故選擇臣藥白芍進(jìn)行研究?，F(xiàn)代研究表明［10-11］白芍具有抗炎鎮(zhèn)痛、保肝、擴(kuò)張血管、改善心肌肥厚等作用，其藥理作用與柔肝顆粒的功效具有顯著相關(guān)性，故選擇芍藥苷為含量檢測(cè)指標(biāo)，在建立含量測(cè)定方法時(shí)，同時(shí)對(duì)流動(dòng)相、色譜柱、流速、柱溫等進(jìn)行了考察，在綜合考慮儀器的耐用性、色譜峰的分離度、色譜峰峰形、分析時(shí)間等因素后，明確了芍藥苷的檢測(cè)方法，所建立的方法準(zhǔn)確、可靠，重現(xiàn)性好。

本研究所建立的薄層色譜和含量測(cè)定方法能對(duì)柔肝顆粒的質(zhì)量進(jìn)行有效地控制，可為保證柔肝顆粒的臨床應(yīng)用和進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。