摘要：目的：旨在研究運(yùn)動對AMPKα2三種不同基因狀態(tài)鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5/PGC1-MEF2結(jié)合量的影響，以探討運(yùn)動提高骨骼肌MEF2-GLUT4 DNA結(jié)合活性的可能機(jī)制。方法：野生鼠，AMPKα2基因高表達(dá)和敲除鼠各20只，分別隨機(jī)分為安靜對照組和跑臺運(yùn)動組，運(yùn)動時間均為1 h，跑臺速度為20 m/min。運(yùn)動后3 h取材。結(jié)果：野生鼠1 h跑臺運(yùn)動后，骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5與MEF2結(jié)合量顯著減低，而PGC1和MEF2結(jié)合量顯著升高；AMPKα2基因高表達(dá)及敲除鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5與MEF2結(jié)合量與野生鼠相比均沒有顯著差異，AMPKα2基因高表達(dá)鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)PGC1與MEF2結(jié)合量顯著高于野生鼠。結(jié)論：運(yùn)動可能通過減少骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)MEF2和HDAC5結(jié)合量，并提高M(jìn)EF2和PGC1的結(jié)合量而調(diào)節(jié)MEF2/GLUT4結(jié)合活性；AMPKα2參與調(diào)解運(yùn)動誘導(dǎo)的MEF2/GLUT4的結(jié)合活性的增加并不是通過降低HDAC5和MEF2結(jié)合量實(shí)現(xiàn)的，而是通過提高PGC1與MEF2結(jié)合量增多而實(shí)現(xiàn)。

關(guān)鍵詞：葡萄糖運(yùn)載體4；肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2；組蛋白去乙?；?；過氧化物酶體增生物激活受體γ共激活因子1

中圖分類號：G8047文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1007-3612（2012）10-0063-07

Effects of Exercises on the Association Volume of the Nuclear HDAC5/PGC1 Associated with MEF2 in Skeletal Muscle of AMPKα2-WT/KO/OE Mice

GONG Hao-jie1， XIE Jin2， ZHANG Nan2， ZHANG Ying2

（1. College of Physical Education， Henan Scientific and Technical University， Luoyang 471003， Henan China； 2. Beijing Sport University， Beijing 100084， China）

Abstract：Objective： The effects of exercise on the content of MEF2–bound HDAC5/PGC1 were investigated in skeletal muscle of AMPKα2-WT/KO/OE mice to explore the possible mechanism of improving the association activity of the MEF2-GLUT4 DNA of skeletal muscle. Methods： Wild-type （WT； n=20）， AMPKα2 over-expression （OE； n=20） and knockout （KO； n=20） C57/BL mice were randomly subdivided into two groups： control group and exercise group. Mice were killed 3 h after treadmill running for 60 min at 20 m/min on the experimental day. Results： After one hour running exercise， MEF2–bound HDAC5 decreased， whereas MEF2–bound PGC1 increased in wild type mice. MEF2 bound HDAC5 was normal in α2-OE and α2-KO muscles after 1 hour exercise. MEF2-combined PGC1 in OE mice was higher than that in WT mice. Conclusion： Exercise increases binding of MEF2A binding by decreasing HDAC5-MEF2 complexes and increasing PGC1-MEF2 complexes； Exercise-induced AMPK activation increases the binding of MEF2A to the Glut4 promoter by a mechanism not involving the decreased nuclear HDAC5-MEF2 complexes， but involving the increased nuclear PGC-1 combined with MEF2.

Key words：GLUT4； MEF2； HDAC5；PGC1

肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2（myocyte enhancer factor 2，MEF2）是葡萄糖運(yùn)載體4（glucose transporter 4，GLUT4）蛋白轉(zhuǎn)錄過程的必需因子，MEF2通過和GLUT4啟動子區(qū)域MEF2結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合而開啟GLUT4基因的轉(zhuǎn)錄[18，27，36]。大量研究表明運(yùn)動同樣通過提高M(jìn)EF2/GLUT4結(jié)合活性而提高GLUT4的表達(dá)[21，33，34]。通過轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)，我們[1]前期的研究發(fā)現(xiàn)，一小時不同強(qiáng)度跑臺運(yùn)動后腺苷酸活化的蛋白激酶（5’-AMP activated protein kinase，AMPKα2）轉(zhuǎn)基因鼠MEF2/GLUT4結(jié)合活性顯著高于野生鼠，而AMPKα2基因敲除鼠MEF2/GLUT4結(jié)合活性顯著低于野生鼠，提示了AMPKα2參與調(diào)解了運(yùn)動誘導(dǎo)的MEF2-GLUT4 DNA結(jié)合活性的提高，但機(jī)制尚不清楚。

有研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙?；?（Histone deacetylase 5，HDAC5）可與MEF2發(fā)生特異性結(jié)合[19，24]，并通過改變真核細(xì)胞染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)，抑制MEF2和GLUT4 啟動子區(qū)域DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，抑制GLUT4轉(zhuǎn)錄。而過氧化物酶體增生物激活受體γ共激活因子1（ peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator1， PGC1）同樣可以與MEF2發(fā)生特異性結(jié)合[16，28]，并通過招募核呼吸因子1（nuclear respiratory-1，NRF-1）等具有組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶（histone acetyhransferases，HATs）活性的共同激活因子，促進(jìn)MEF2和GLUT4啟動子區(qū)域DNA結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)GLUT4的轉(zhuǎn)錄。利用純化的AMPK孵育HDAC5蛋白或利用AMPK藥物激活劑5-氨基-4甲酰胺咪唑核糖核苷酸（5’-aminoimidazole-4carboxamide-riboside，AICAR）刺激骨骼肌細(xì)胞[22]，均發(fā)現(xiàn)HDAC5 ser259和ser498位點(diǎn)磷酸化水平顯著增加。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase， MAPK） 亞家族成員P38，作為目前所發(fā)現(xiàn)及證實(shí)的PGC1上游激酶，對PGC1磷酸化水平有重要調(diào)節(jié)作用[14，17]，而它的活性同樣受到AMPK的調(diào)節(jié)[23]。由于HDAC5的S295和S498位點(diǎn)的磷酸化，能夠引起HDAC5與MEF2的分離[19]，而PGC1的磷酸化，能夠引起PGC1和MEF2的結(jié)合[28]，推測AMPK可能通過調(diào)節(jié)HDAC5/PGC1和MEF2的結(jié)合量來影響MEF2-GLUT4 DNA結(jié)合活性。

本研究在我們以往研究的基礎(chǔ)上[1]，進(jìn)一步研究1 h跑臺運(yùn)動對AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠和AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5/PGC1-MEF2結(jié)合量，核內(nèi)HDAC5/PGC1以及總HDAC5蛋白含量的影響，以探討運(yùn)動提高骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)MEF2/GLUT4結(jié)合活性的可能機(jī)制。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)對象C57BL/6J野生（Wild-type， WT）小鼠、AMPKα2基因高表達(dá)（over-expression， OE）和基因敲除鼠（Knockout， KO）各20只，分別隨機(jī)分為安靜對照（control， C）和跑臺運(yùn)動組（Exercise， E），共6組，每組10只[1，2]（表1）。

1.2運(yùn)動方案和取材運(yùn)動組小鼠采用跑臺運(yùn)動方式，跑臺坡度為 0 角度，跑臺速度為 20 m/min，運(yùn)動時間為1 h[1]，并于運(yùn)動后3 h取材后，-80℃保存?zhèn)溆肹2]。

1.3指標(biāo)測定

1.3.1HDAC5/PGC1蛋白表達(dá)量HDAC5和PGC1蛋白表達(dá)量采用免疫印跡（Western Blot）法，結(jié)果以實(shí)驗(yàn)組目的蛋白表達(dá)相對值與安靜對照組目的蛋白表達(dá)相對值比值表示[1，2]。

1.3.2HDAC5/PGC1-MEF2結(jié)合量HDAC5/PGC1-MEF2結(jié)合量采用免疫共沉淀法（co-immunoprecipitation，CoIP）測定，結(jié)果以實(shí)驗(yàn)組HDAC5/PGC1蛋白表達(dá)相對值與安靜對照組HDAC5/PGC1蛋白表達(dá)相對值比值表示[4，5]。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計實(shí)驗(yàn)統(tǒng)計使用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)分析軟件完成，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，顯著性水平為P<0.05。

2實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1總HDAC5蛋白相對表達(dá)量由圖2看出：無論

圖1總HDAC5蛋白表達(dá)圖譜

圖2總HDAC5蛋白相對表達(dá)量

是野生鼠，AMPKα2高表達(dá)鼠，還是AMPKα2基因敲除鼠，1 h跑臺運(yùn)動后，骨骼肌細(xì)胞總HDAC5蛋白相對表達(dá)量與安靜對照組相比均沒有顯著差異。無論是安靜對照組還是跑臺運(yùn)動組，AMPKα2三種不同基因狀態(tài)鼠相比，骨骼肌細(xì)胞總HDAC5蛋白相對表達(dá)量均沒有出現(xiàn)顯著差異。

2.2核內(nèi) HDAC5蛋白相對表達(dá)量由圖4看出：無論是野生鼠，AMPKα2高表達(dá)鼠，還是AMPKα2基因敲除鼠，1 h跑臺運(yùn)動后，骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5蛋白相對表達(dá)量與安靜對照組相比均顯著降低。安靜對照組，AMPKα2三種不同基因狀態(tài)鼠相比，骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5蛋白相對表達(dá)量沒有出現(xiàn)顯著差異，1 h跑臺運(yùn)動后，AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5蛋白相對表達(dá)量顯著低于野生鼠，而AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5蛋白相對表達(dá)量與野生鼠沒有顯著差異。

圖3核內(nèi)HDAC5蛋白表達(dá)圖譜

圖4核內(nèi)HDAC5蛋白相對表達(dá)量

注：與安靜對照組比較，*P<0.05。與野生鼠比較，#P<0.05。

2.3HDAC5-MEF2結(jié)合量由圖6看出：無論是野生鼠，AMPKα2高表達(dá)鼠，還是AMPKα2基因敲除鼠，1 h跑臺運(yùn)動后，骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5-MEF2結(jié)合量與安靜對照組相比均顯著降低。無論是安靜對照組，還是跑臺運(yùn)動組，AMPKα2三種不同基因狀態(tài)鼠相比，骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5-MEF2結(jié)合量均沒有出現(xiàn)顯著差異。

圖5HDAC5-MEF2蛋白表達(dá)圖譜

圖6HDAC5-MEF2結(jié)合量

注：與安靜對照組比較，*P<0.05。

2.4核內(nèi) PGC1蛋白相對表達(dá)量由圖8看出：無論是野生鼠，AMPKα2高表達(dá)鼠，還是AMPKα2基因敲除鼠，1 h跑臺運(yùn)動后，骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)PGC1蛋白相對表達(dá)量與安靜對照組相比均沒有顯著差異。無論是安靜對照組還是跑臺運(yùn)動組，AMPKα2三種不同基因狀態(tài)鼠相比，骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)PGC1蛋白相對表達(dá)量均沒有出現(xiàn)顯著差異。

圖7核內(nèi)PGC1蛋白表達(dá)圖譜

圖8核內(nèi)PGC1蛋白相對表達(dá)量

2.5PGC1-MEF2結(jié)合量由圖10看出：無論是野生鼠，AMPKα2高表達(dá)鼠，還是AMPKα2基因敲除鼠，1 h跑臺運(yùn)動后，骨骼肌細(xì)胞核內(nèi) PGC1-MEF2結(jié)合量與安靜對照組相比均顯著升高。安靜對照組，AMPKα2三種不同基因狀態(tài)鼠相比，骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)PGC1-MEF2結(jié)合量沒有出現(xiàn)顯著差異，1 h跑臺運(yùn)動后，AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)PGC1-MEF2結(jié)合量顯著高于野生鼠，而AMPK α2基因敲除鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)PGC1-MEF2結(jié)合量與野生鼠沒有顯著差異。

圖9PGC1-MEF2蛋白表達(dá)圖譜

圖10PGC1-MEF2結(jié)合量

注：與安靜對照組比較，*P<0.05。與野生鼠比較，#P<0.05。

3分析討論

3.1運(yùn)動對野生鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5/PGC-MEF2結(jié)合量以及HDAC5/PGC1蛋白含量的影響研究顯示，基礎(chǔ)狀態(tài)下，HDAC5和MEF2結(jié)合在一起，并抑制MEF2對靶基因的轉(zhuǎn)錄[17，22]。盡管HDAC5能抑制MEF2與靶基因DNA的結(jié)合，但HDAC5并不是直接連接到MEF2靶基因DNA上[23]。HDAC5通過對真核細(xì)胞染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)單位核小體組蛋白賴氨酸側(cè)鏈的去乙?；?，并與原本帶負(fù)電荷的核小體DNA主鏈緊密結(jié)合形成致密的核小體結(jié)構(gòu)，這種致密的核小體結(jié)構(gòu)阻礙了MEF2作為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在靶基因啟動子區(qū)域DNA結(jié)合位點(diǎn)開啟基因轉(zhuǎn)錄的通路，從而抑制轉(zhuǎn)錄[26]。HDAC5的活性與其磷酸化水平高度正相關(guān)，特別是HDAC5的S295和S498位點(diǎn)的磷酸化，能夠引起HDAC5與MEF2分離，并通過與14-3-3蛋白伴侶結(jié)合后轉(zhuǎn)移出核，解除對轉(zhuǎn)錄因子的活性抑制[12，15]。

隨著HDAC5的分離，染色質(zhì)去乙酰化狀態(tài)必須恢復(fù)到乙?；癄顟B(tài)，這一過程需要HATs參與[23，26]。HATs能使真核細(xì)胞染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)單位核小體組蛋白賴氨酸殘基側(cè)鏈重新乙?；痆23]，從而解除組蛋白和DNA骨架的致密結(jié)合，暴露轉(zhuǎn)錄因子啟動子結(jié)合區(qū)域，使轉(zhuǎn)錄因子能夠順利的與之結(jié)合，促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行[26]。研究顯示HATs是主要受PGC1通路的影響[32]，基礎(chǔ)狀態(tài)下，由于PGC1和抑制蛋白結(jié)合，抑制了對靶基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)作用[14，17]。PGC1的活性同樣與其磷酸化水平高度正相關(guān)，當(dāng)PGC1被其上游激酶磷酸化后，能夠引起PGC1和抑制蛋白的分離[14，17]并與轉(zhuǎn)錄因子（如MEF2）結(jié)合[13]，之后通過招募NRF1等具有HATs活性的共同激活因子完成對轉(zhuǎn)錄因子依賴型基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)[16，28]。

利用GLUT4熒光素酶報告基因（該片段包含MEF2結(jié)合位點(diǎn)）轉(zhuǎn)染人體骨骼肌細(xì)胞[22]，發(fā)現(xiàn)如果共轉(zhuǎn)染MEF2質(zhì)粒，熒光霉素活性顯著增加；如果共轉(zhuǎn)MEF2和HDAC5 質(zhì)粒，熒光素酶活性增加并不顯著，提示了HDAC5抑制轉(zhuǎn)錄因子MEF2對GLUT4基因的轉(zhuǎn)錄活性；而如果共轉(zhuǎn)染MEF2和PGC1質(zhì)粒[11]，熒光霉素活性比單純轉(zhuǎn)染MFE2質(zhì)粒增加更為顯著，提示了PGC1加強(qiáng)了轉(zhuǎn)錄因子MEF2對GLUT4基因的轉(zhuǎn)錄活性。如前所述，HDAC5和PGC1作為調(diào)節(jié)MEF2對目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)節(jié)因子，它們必須與MEF2結(jié)合發(fā)揮作用，運(yùn)動能夠引起MEF2對GLUT4基因轉(zhuǎn)錄活性的增加[21，33，34]，那么運(yùn)動對HDAC5/PGC1和MFE2結(jié)合量會產(chǎn)生什么影響呢？

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)野生鼠1 h跑臺運(yùn)動后骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5與MEF2結(jié)合量顯著減低，而PGC1和MEF2結(jié)合量顯著升高，提示了適當(dāng)強(qiáng)度的一次運(yùn)動可以引起骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)MEF2與HDAC5的分離及與PGC1的結(jié)合。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)運(yùn)動后骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5含量顯著降低的同時，細(xì)胞總HDAC5含量卻沒有顯著變化，與以往離體研究結(jié)果[12，15]相一致，推測運(yùn)動引起的從MEF2-HDAC5復(fù)合體上分離出來的HDAC5同樣并不是殘留在細(xì)胞核內(nèi)而是轉(zhuǎn)運(yùn)出核。以往離體研究結(jié)果顯示，基礎(chǔ)狀態(tài)下細(xì)胞核內(nèi)PGC1與抑制蛋白相結(jié)合，當(dāng)PGC1被激活之后，細(xì)胞核內(nèi)PGC1與抑制蛋白分離，并在細(xì)胞核內(nèi)與MEF2結(jié)合，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄[14，17]。本實(shí)驗(yàn)雖然沒有測定PGC1與抑制蛋白結(jié)合量的多少，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)野生鼠1 h跑臺運(yùn)動后，骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)PGC1和MEF2結(jié)合量顯著升高的同時，骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)PGC1含量并沒有顯著變化，同樣提示了和HDAC5結(jié)合的PGC1來源于細(xì)胞核內(nèi)部，是細(xì)胞核內(nèi)部PGC1蛋白重新分布的結(jié)果。

3.2運(yùn)動對AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5/PGC-MEF2結(jié)合量以及HDAC5/PGC1蛋白含量的影響運(yùn)動能夠引起MEF2與HDAC5的分離及與PGC1的結(jié)合，但機(jī)制尚不清楚。體外實(shí)驗(yàn)顯示，利用純化的AMPK孵育HDAC5蛋白[22]，HDAC5磷酸化水平顯著增加，而如果突變HDAC5蛋白Ser-259和Ser-498位點(diǎn)，HDAC5磷酸化水平則顯著降低。如前所述，HDAC5的S295和S498位點(diǎn)的磷酸化，能夠引起HDAC5與MEF2分離，并通過與14-3-3蛋白伴侶結(jié)合后轉(zhuǎn)移出核，解除對轉(zhuǎn)錄因子的活性抑制[12，15]，提示了AMPK對骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5和MEF2的結(jié)合量以及核內(nèi)HDAC5含量有重要調(diào)節(jié)作用。這一發(fā)現(xiàn)在骨骼肌細(xì)胞中得到了進(jìn)一步證實(shí)，利用AMPK藥物激活劑AICAR刺激骨骼肌細(xì)胞[22]，發(fā)現(xiàn)HDAC5 ser259和ser498位點(diǎn)磷酸化均顯著增加，細(xì)胞核內(nèi)HDAC5蛋白顯著降低，且細(xì)胞內(nèi)總HDAC5蛋白含量沒有變化。

關(guān)于PGC1和MEF2結(jié)合是否受AMPK的直接調(diào)節(jié)目前尚不清楚，但有研究顯示AMPK可以激活PGC1的上游激酶P38[5，14]。作為目前所發(fā)現(xiàn)及證實(shí)的PGC1上游激酶，P38的激活可以引起PGC1磷酸化水平的顯著增高[14，17]。如前所述，PGC1被磷酸化后，能夠引起PGC1和抑制蛋白的分離并與MEF2結(jié)合，之后通過招募NRF1等具有HATs活性的共同激活因子完成對轉(zhuǎn)錄因子依賴型基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)[28]。由于運(yùn)動同樣激活A(yù)MPK[10，35]，這些結(jié)果提示了AMPK可能同樣參與了運(yùn)動引起的骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)PGC1和MEF2結(jié)合量的增加。然而值得注意的是，以上結(jié)果只是從離體實(shí)驗(yàn)中得出，其不一定能真實(shí)地反映在體骨骼肌細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白之間的結(jié)合的狀況，提示了這些結(jié)果具有一定的局限性。

1 h跑臺運(yùn)動后，AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5與MEF2結(jié)合量與野生鼠相比沒有顯著差異，則提示了AMPKα2可能對運(yùn)動誘導(dǎo)的HDAC5和MEF2的分離并不起主要作用。雖然以往有離體實(shí)驗(yàn)研究顯示AMPK對HDAC5有磷酸化作用，但相對于在體實(shí)驗(yàn)而言，AICAR只是單一的運(yùn)動模擬信號，遠(yuǎn)沒有在體情況下運(yùn)動對機(jī)體的刺激作用復(fù)雜[8，38]。另外，即使是離體實(shí)驗(yàn)研究，也只研究了AMPK對HDAC5的調(diào)節(jié)作用，尚未深入到對AMPKα1和α2亞基對HDAC5調(diào)節(jié)作用的研究[22]，并不能排除AMPKα1亞基對HDAC5的調(diào)節(jié)效果更顯著的可能，總之可以肯定的是AMPKα2并未對運(yùn)動誘導(dǎo)的HDAC5-MEF2復(fù)合物分解以及HDAC5的轉(zhuǎn)移出核發(fā)揮決定性作用。而本研究發(fā)現(xiàn)1 h跑臺運(yùn)動后，AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)PGC1與MEF2結(jié)合量顯著高于野生鼠，這個結(jié)果與我們實(shí)驗(yàn)假設(shè)相一致，提示AMPKα2參與調(diào)解了運(yùn)動誘導(dǎo)的PGC1和MEF2的結(jié)合量的增加。

AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠，1 h跑臺運(yùn)動后，HDAC5總蛋白與野生鼠相比沒有顯著差異，而骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5蛋白含量顯著低于野生鼠，其原因尚不明確。有研究顯示HDAC5作為轉(zhuǎn)錄共抑制因子，除作用于轉(zhuǎn)錄因子MEF2以外還有其他轉(zhuǎn)錄因子[9]，如在真核生物發(fā)育過程中起重要作用的堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子（Basic helix-loop-helix，BHLH）。因此我們可以推測運(yùn)動可能不僅減少了HDAC5與MEF2的結(jié)合，也減少了HDAC5與其他轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。由于AMPKα2的轉(zhuǎn)基因，引起HDAC5和其他轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合量下降及轉(zhuǎn)移出核量更為顯著，導(dǎo)致了其核內(nèi)HDAC5蛋白含量顯著低于野生鼠，具體機(jī)制尚待研究發(fā)現(xiàn)。另外本研究中1 h跑臺運(yùn)動后，AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)PGC1量顯著與野生鼠相比沒有顯著差異，則進(jìn)一步提示了與MEF2結(jié)合的PGC1并不是來源于細(xì)胞核外部，是細(xì)胞核內(nèi)部PGC1重新分布的結(jié)果。

3.3運(yùn)動對AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5/PGC-MEF2結(jié)合量以及HDAC5/PGC1蛋白含量的影響本研究中1 h跑臺運(yùn)動后，AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5與MEF2結(jié)合量，核內(nèi)HDAC5以及總HDAC5蛋白含量，與野生鼠相比均沒有顯著差異，則進(jìn)一步提示了運(yùn)動誘導(dǎo)的HDAC5和MEF2分離并出核并非通過AMPKα2調(diào)節(jié)。鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶（Calcium/calmodulin-dependent protein kinase，CAMK）是一類廣泛分布的絲/蘇氨酸蛋白激酶家族，早期研究顯示，CAMKⅠ和Ⅳ亞型對HDAC5的ser-259和ser-498位點(diǎn)有磷酸化作用，并能促使HDAC5與MEF2分離并與其伴侶蛋白14-3-3結(jié)合并轉(zhuǎn)移出細(xì)胞核[24，25]。但后來的研究顯示CAMKⅠ和Ⅳ在骨骼肌細(xì)胞中并不表達(dá)[20，29]。Johannes Backs等的[6，7]研究發(fā)現(xiàn)，主要存在于骨骼肌中的CAMKⅡ，雖然并不能直接磷酸化HDAC5，但CAMKⅡ可與HDAC4結(jié)合并對其有磷酸化作用，而HDAC5在細(xì)胞內(nèi)則是通過N末端結(jié)構(gòu)保守的螺旋狀區(qū)域與HDAC4形成二聚體，當(dāng)HDAC4被CAMKⅡ磷酸化的同時，HDAC4也將這一信號傳遞給HDAC5，即HDAC5通過HDAC4被CAMKⅡ間接磷酸化。

值得注意的是CaMKⅡ?qū)DAC5的間接磷酸化作用是在心肌肥大模型中發(fā)現(xiàn)的，對于骨骼肌細(xì)胞是否同樣有此作用還有待進(jìn)一步研究。另有研究顯示與CAMK 結(jié)構(gòu)催化區(qū)具有高度序列同源性的蛋白激酶D（Protein Kinase D，PKD）也參與細(xì)胞核內(nèi)對HDAC5和MEF2結(jié)合的調(diào)控作用[37]。PKD可被蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC）激活，而PKD被激活之后則能直接磷酸化HDAC5與其伴侶蛋白14-3-3的結(jié)合位點(diǎn)，促進(jìn)HDAC5與之結(jié)合后轉(zhuǎn)移出核[37]。由于PKD與CAMKⅡ的高度系列同源性，再加上這兩條通路對HDAC5的作用位點(diǎn)相同[9，31]，推測這兩條通路很可能同時競爭性的參與了HDAC5與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合以及其核內(nèi)外定位。運(yùn)動同樣激活CAMK和PKC-PKD通路[29，30]，提示了CAMK和PKC-PKD通路，同樣參與調(diào)節(jié)了運(yùn)動誘導(dǎo)的HDAC5和MEF2的分離?？傊\(yùn)動對骨骼肌HDAC5的調(diào)節(jié)是個復(fù)雜的過程，本實(shí)驗(yàn)中小鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5與轉(zhuǎn)錄因子MEF2的分離以及轉(zhuǎn)移出核，可能是通過AMPKα1、CAMKⅡ、PKD中的一條或幾條通路共同作用的結(jié)果，而并非通過AMPKα2途徑調(diào)節(jié)，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

本研究中1 h跑臺運(yùn)動后，AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)PGC1與MEF2結(jié)合量顯著高于野生鼠，但AMPKα2基因敲除小鼠1 h跑臺運(yùn)動后，骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)PGC1-MEF2的結(jié)合量相對野生小鼠沒有顯著性變化，提示了雖然AMPKα2參與調(diào)解了運(yùn)動誘導(dǎo)的PGC1和MEF2的結(jié)合量的增加，但機(jī)體還存在有其他的代償機(jī)制。事實(shí)上，p38作為PGC1的上游激酶，AMPK的轉(zhuǎn)基因雖然可以引起P38磷酸化水平顯著升高，但AMPKα2基因敲除同樣沒有影響p38的磷酸化水平[3]，因此我們推測，由于AMPKα2的缺失，機(jī)體存在的調(diào)節(jié)P38的其他代償機(jī)制（具體見我們實(shí)驗(yàn)室賀強(qiáng)等的研究[3]）可能代償了AMPKα2對P38的調(diào)節(jié)作用，導(dǎo)致了AMPKα2基因敲除沒有影響運(yùn)動后骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)PGC1-MEF2的結(jié)合量的變化，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)。

4結(jié)論

通過轉(zhuǎn)基因和基因敲除技術(shù)，我們以往的研究[1]發(fā)現(xiàn)，一小時不同強(qiáng)度跑臺運(yùn)動后，野生鼠MEF2/GLUT4結(jié)合活性顯著升高，AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠MEF2/GLUT4結(jié)合活性顯著高于野生鼠，而AMPKα2基因敲除鼠MEF2/GLUT4結(jié)合活性顯著低于野生鼠，提示了AMPKα2參與調(diào)解了運(yùn)動誘導(dǎo)的MEF2-GLUT4 DNA結(jié)合活性的提高。

HDAC5和PGC1作為影響MEF2對GLUT4基因轉(zhuǎn)錄活性的主要調(diào)節(jié)因子，本實(shí)驗(yàn)通過研究運(yùn)動對AMPKα2三種不同基因狀態(tài)鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5 /PGC1-MEF2結(jié)合量的影響，發(fā)現(xiàn)：

1）1 h跑臺運(yùn)動后，野生鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5與MEF2結(jié)合量顯著減低，PGC1和MEF2結(jié)合量顯著升高，提示了運(yùn)動可能通過減少骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)MEF2和HDAC5結(jié)合量，并提高M(jìn)EF2和PGC1的結(jié)合量而調(diào)節(jié)MEF2/GLUT4 DNA結(jié)合活性；

2）1 h跑臺運(yùn)動后，AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠及AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5與MEF2結(jié)合量與野生鼠相比均沒有顯著差異，則提示了AMPKα2參與調(diào)解運(yùn)動誘導(dǎo)的MEF2/GLUT4的結(jié)合活性的增加并不是主要通過影響骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)HDAC5和MEF2結(jié)合量實(shí)現(xiàn)的；

3）1 h跑臺運(yùn)動后，雖然AMPKα2基因敲除鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)PGC1與MEF2結(jié)合量與野生鼠相比沒有顯著差異，但AMPKα2轉(zhuǎn)基因鼠骨骼肌細(xì)胞核內(nèi)PGC1與MEF2結(jié)合量顯著高于野生鼠，則提示了“運(yùn)動-AMPKα2激活-PGC1與MEF2結(jié)合量增多-MEF2/GLUT4 DNA活性升高”這一通路的存在。

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