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        反相HPLC法測(cè)定雷公藤內(nèi)酯醇的含量和有關(guān)物質(zhì)

        2012-12-31 00:00:00司徒潔敏賈國(guó)慧
        上海醫(yī)藥 2012年21期

        摘要 目的:建立反相高效液相色譜法,測(cè)定雷公藤內(nèi)酯醇的含量和有關(guān)物質(zhì)。方法:采用Discovery SUPELCO C18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈-水為流動(dòng)相,含量等度洗脫測(cè)定、有關(guān)物質(zhì)梯度洗脫測(cè)定,檢測(cè)波長(zhǎng)219 nm,柱溫25 ℃。結(jié)果:雷公藤內(nèi)酯醇含量測(cè)定方法中,樣品溶液在8~48 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(R2= 1.000 0),平均回收率為99.48%,RSD為0.59%,溶液穩(wěn)定性好。結(jié)論:方法快速、準(zhǔn)確,專(zhuān)屬性好,靈敏度符合測(cè)定要求。

        關(guān)鍵詞 雷公藤內(nèi)酯醇 雷公藤內(nèi)酯酮 梯度洗脫 高效液相色譜

        中圖分類(lèi)號(hào):O657.72; R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):1006-1533(2012)21-0049-04

        雷公藤內(nèi)酯醇是第一個(gè)被確認(rèn)具有松香烷結(jié)構(gòu)的二萜類(lèi)三環(huán)氧內(nèi)酯化合物。自1936年以來(lái)從雷公藤中已分離出多種有效成分,主要是生物堿類(lèi)、二萜類(lèi)、三萜類(lèi)、倍半萜類(lèi)及多糖,其中二萜類(lèi)物質(zhì)雷公藤內(nèi)酯醇為主要有效藥理成分,具有抗炎、免疫抑制、抗腫瘤等多種生物活性[1];此外,雷公藤內(nèi)酯醇能誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡,抑制多種在自身免疫系統(tǒng)疾病和排異反應(yīng)中起重要作用的前致炎細(xì)胞因子的表達(dá)[2]。目前本品標(biāo)準(zhǔn)尚未收錄于中國(guó)藥典,文獻(xiàn)資料多報(bào)道雷公藤藥材或制劑中雷公藤內(nèi)酯醇提取物的含量測(cè)定[3,4]。本文根據(jù)樣品來(lái)源特點(diǎn)及質(zhì)量控制關(guān)鍵點(diǎn),針對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇試制品及其主要雜質(zhì)內(nèi)酯酮的質(zhì)量監(jiān)測(cè),采用乙腈-水為流動(dòng)相體系[5],研究并建立高效液相色譜方法,可快速、準(zhǔn)確測(cè)定雷公藤內(nèi)酯醇的含量和有關(guān)雜質(zhì)。

        1 儀器與試藥

        Agilent 1100液相色譜儀,DAD檢測(cè)器。色譜柱為Discovery SUPELCO C18(150 mm×4.6 mm,5 μm)。雷公藤內(nèi)酯醇試制品:上海皓元化學(xué)科技有限公司(批號(hào):20070430、20070604、20070911、20071025);雷公藤內(nèi)酯醇標(biāo)準(zhǔn)品:中國(guó)藥品生物制品檢定所(批號(hào):111567-200502,20 mg/支);乙腈:色譜純(Fisher試劑);水:純化水(密理博純水儀制備)。

        2 試驗(yàn)方法與結(jié)果[6]

        2.1 含量測(cè)定

        2.1.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性

        流動(dòng)相:乙腈-水(24∶76);流速:1 ml/min;檢測(cè)波長(zhǎng):219 nm;柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量:10 μl。理論板數(shù)按雷公藤內(nèi)酯醇峰計(jì)算應(yīng)不低于5 000,雷公藤內(nèi)酯醇和雷公藤內(nèi)酯酮峰的分離度應(yīng)大于1.5。

        2.1.2 線性關(guān)系

        2.1.3 精密度試驗(yàn)(重復(fù)性)

        2.1.4 穩(wěn)定性測(cè)定

        2.1.5 回收率試驗(yàn)

        2.1.6 定量限

        2.2 有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)方法

        2.2.1 色譜條件和系統(tǒng)適用性

        2.2.2 專(zhuān)屬性考察

        2.2.3 靈敏度試驗(yàn)

        取2.1.2項(xiàng)下濃度8 μg/ml的溶液,再等比稀釋成一系列濃度的溶液,取10 μl注入液相色譜儀,記錄色譜圖,計(jì)算信噪比。當(dāng)濃度為0.04 μg/ml時(shí),其S/N≈3,最小檢測(cè)限為0.4 ng,靈敏度符合測(cè)定要求。

        2.3 三批樣品測(cè)定結(jié)果

        3 討論

        雷公藤內(nèi)酯醇不溶于水,溶于二甲亞砜、甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑,并在這些溶劑中穩(wěn)定,在配制溶液時(shí)應(yīng)先用適量乙腈溶解,再用流動(dòng)相稀釋。在預(yù)試驗(yàn)時(shí)考察甲醇-水、乙腈-水不同流動(dòng)相體系,結(jié)果表明以乙腈-水為流動(dòng)相系統(tǒng)梯度洗脫時(shí),待測(cè)組分雷公藤內(nèi)酯醇、內(nèi)酯酮與其它組分能有效分離,結(jié)果準(zhǔn)確可靠,峰形更好。另外,將雷公藤內(nèi)酯醇和內(nèi)酯酮的混合對(duì)照品在200~400 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,最大吸收波長(zhǎng)為219 nm,故最終選擇乙腈-水作為流動(dòng)相梯度洗脫,219 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

        本研究用的雷公藤內(nèi)酯醇試制品是從天然植物雷公藤根皮或葉子中提取得到的,工藝過(guò)程是以醇水浸提植物、濃縮、水洗、氯仿提取、過(guò)柱、丙酮重結(jié)晶等流程得到的。本研究目的是建立一種適應(yīng)樣品來(lái)源的HPLC分析方法,作為一種定量分析方法,重復(fù)性好(RSD<0.2%)、線性關(guān)系良好(R2=1.000)及準(zhǔn)確性高。有關(guān)物質(zhì)的分析方法為梯度洗脫,具有較高的專(zhuān)屬性,尤其是對(duì)其中的雷公藤內(nèi)酯酮的控制,為雷公藤內(nèi)酯醇試制品的質(zhì)量控制提供了快速、準(zhǔn)確的方法。

        此外,該試制品是我公司一類(lèi)新藥雷騰舒的起始原料,其品質(zhì)將直接影響成品的質(zhì)量情況和穩(wěn)定性,因此建立穩(wěn)定、可靠的質(zhì)量控制指標(biāo),從源頭把好質(zhì)量關(guān),非常重要。本研究針對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇含量、有關(guān)物質(zhì)這兩個(gè)關(guān)鍵質(zhì)量項(xiàng),建立了方法,并通過(guò)詳細(xì)的驗(yàn)證確保方法的準(zhǔn)確、可靠和可重復(fù),為成品的質(zhì)量提供了良好的保障。

        參考文獻(xiàn)

        [1] 段冶, 魏晨, 張學(xué)強(qiáng). HPLC法檢測(cè)雷公藤超聲提取物中雷公藤內(nèi)酯醇的含量[J]. 中醫(yī)藥信息, 2009, 26 (1): 79-80.

        [2] Brinker AM, Raskin I. Determination of triptolide in root extracts of Tripterygium wilfordii by solid-phase extraction and reverse-phase high-performance liquid chromatography[J]. J Chromatogr A, 2005, 1070 (1-2): 65-70.

        [3] 張志勇, 陳潔, 程艷霞, 等. 高效液相色譜法測(cè)定海棠合劑中雷公藤內(nèi)酯醇含量[J]. 中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志, 2005, 25(2): 120-121.

        [4] 喻錄容, 劉新, 明遜, 等. HPLC法測(cè)定雷公藤緩釋膠囊中雷公藤內(nèi)酯醇的含量[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 2006, 31(1): 117-118+133.

        [5] 褚克丹, 李煌, 徐偉, 等. HPLC法測(cè)定雷公藤內(nèi)酯醇和內(nèi)酯酮的含量[J]. 福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2011, 21(5): 27-29.

        [6] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典2010年版(二部)[M]. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2010: 194-195, ⅩⅨA.

        (收稿日期:2012-07-03)

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