[摘要] 目的 研究對比162例淋巴結結核的診斷方法。 方法 選取浙江省金華市中心醫(yī)院于2008年1月～2010年6月經細針穿刺細胞學診斷淋巴結結核或可疑結核的病例，穿刺組織同時進行抗酸染色、細菌培養(yǎng)及PCR擴增檢測結核分枝桿菌DNA（TB—DNA）。 結果 TB—DNA陽性117例，陽性率為72.2%；抗酸染色陽性71例，陽性率為43.8%；細菌培養(yǎng)陽性99例，陽性率為61.1%；在61例FNAC直接診斷結核的病例，PCR及細菌培養(yǎng)陽性率明顯高于抗酸染色（χ2值均為13.739，P < 0.01），在101例FNAC診斷為可疑結核或不排除結核的病例，PCR陽性率高于細菌培養(yǎng)及抗酸染色（χ2值分別為6.706、13.612，P均<0.01）；抗酸染色及細菌培養(yǎng)陽性的病例TB—DNA均陽性； FNAC結合PCR結果可明確診斷80.9%結核。 結論 FNAC是診斷淋巴結結核簡便有效的方法， PCR擴增高效、快速、敏感、特異，可作為FNAC診斷結核很好的補充，F(xiàn)NAC結合PCR技術是較好的淋巴結結核的診斷方法。

[關鍵詞] 細針穿刺；細胞學；聚合酶鏈反應；結核；淋巴結

[中圖分類號] R522 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673—9701（2012）26—0021—03

Comparative evaluation of the diagnostic method in 162 cases of tuberculous lymphadenitis

WANG Lixia1 ZHU Fang1 SHEN Wei2 ZHU Yijun3

1.Department of Pathology， Jinhua Central Hospital in Zhejiang Province， Jinhua 321000， China；2.Department of Hepatobiliary Surgery， Jinhua Central Hospital in Zhejiang Province， Jinhua 321000， China；3.Department of Laboratory， Jinhua Central Hospital in Zhejiang Province， Jinhua 321000， China

[Abstract] Objective To evaluate the diagnostic method in 162 cases of tuberculous lymphadenitis. Methods A—total of 162 cases of tuberculous lymphadenitis were performed by fine needle aspiration cytology（FNAC），as well as acid—fast bacillus stain（AFB）， culture and PCR； Results Among the 162 cases， 117 cases were TB—DNA positive（117/162，72.2%）， while the positivity of AFB was 43.8% （71/162），and culture was 61.1%（99/162）； In 61 definitely diagnosed tuberculous lymphadenitis by FNAC cases， the positive rate of PCR and of culture were significantly higher than which of AFB （P < 0.01）， and in 101 cases which diagnosed suspiciously， the positive rate of PCR was higher than which of AFB and culture （P < 0.01）.The positive cases of AFB and culture were all TB—DNA positive； FNAC combined with PCR can diagnose 80.9% tuberculous lymphadenitis clearly. Conclusion FNAC combined with PCR to test TB—DNA is the most simple and effective diagnostic method of tuberculous lymphadenitis.

[Key words] Fine needle aspiration；Cytology；Polymerase chain reaction；Tuberculosis；Lymph node

結核病可通過空氣經呼吸道傳播，目前全球結核病疫情仍相當嚴峻[1]。我國為世界第二大“結核國”，僅次于印度。近年來肺外結核病的發(fā)病率呈明顯上升且持續(xù)上升趨勢，主要又以淺表淋巴結結核為首，因此探索一種簡便有效的淋巴結結核的確診方法是迫切而首要的任務?，F(xiàn)將我院于2008年1月～2010年6月診斷為淋巴結結核的162例病例情況總結分析，探討各診斷方法的優(yōu)越性及局限性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象 收集浙江省金華市中心醫(yī)院2008年1月～2010年6月診斷為淋巴結結核的162例病例材料。臨床表現(xiàn)為淺表淋巴結腫大，其中男67例，女95例，年齡2～89歲，平均38.2歲，中位年齡42歲。腫塊部位為頸部者88例，其余鎖骨上36例，腋下11例，頜下13例，胸壁6例，腹股溝5例，腰背部2例，臀部1例。詳細詢問病史，23例曾有結核病史，正在服用抗結核藥物或曾經服用抗結核藥物，4例于當?shù)匦l(wèi)生院頸部腫塊切除，術后腫塊復發(fā)并紅腫，硬結，化膿。所有病例電話隨訪6個月以上，56例進行結核菌素（PPD）試驗陽性；44例胸片顯示肺部結核病灶；87例正規(guī)抗結核治療并顯效（腫塊縮小、消失）。

1.1.2 儀器與試劑 LightCycler PCR擴增儀為美國羅氏公司產品；PCR試劑為中山大學達安基因股份有限公司產品；抗酸染色液為珠海貝索生物技術有限公司產品。

1.2 方法

1.2.1 標本的采集 腫塊局部皮膚常規(guī)消毒，采用10 mL一次性注射器（針頭22G），左手固定腫塊，右手保持負壓在腫塊內反復多方向提插數(shù)次，去負壓，分離針頭針筒，拔出針頭，將吸出物打在載玻片上，涂片24張，一張稍干燥用于抗酸染色，其余立即用95%乙醇固定，然后HE染色鏡檢。用細胞學剩余材料或重新穿刺材料進行PCR擴增及結核桿菌培養(yǎng)

1.2.2 PCR法檢測TB—DNA 將穿刺標本用無菌生理鹽水洗滌2次，取50 μL沉渣懸液加50 μL lDNA提取液充分混勻，置100℃沸水浴中10 min，取出后置4℃，6～8 h以保證充分裂解。10000 rpm離心5 min，取上清液2 μL加入專用毛細管中，4000 rpm離心3 min，插入圓形卡盤倒置20 s后放入儀器中設置循環(huán)條件為93℃，2 min預變性，然后經93℃，5 s；57℃，45 s，共40個循環(huán)，37℃延伸1 min。另取陰性質控品、陽性質控品各40μL加等量DNA提取液打勻，沸水浴10min后同上處理。反應結束后自動保存檢測數(shù)據文件，調整熒光記數(shù)值為F1/F2，點擊Quantification讀取結果。以Ct（Cycle threshold）值判斷結果，Ct值<40為陽性，Ct值≥40為陰性。

1.2.3 抗酸染色法找抗酸桿菌 按照試劑說明書進行。主要步驟如下：（1）初染：涂片上滴加石碳酸復紅液，用火焰加熱至產生蒸汽，約5 min（防止染液蒸干），水洗。（2）脫色：第二液（3%鹽酸乙醇）脫色約1 min，輕輕搖動玻片至涂片無紅色脫出或略顯粉紅色時為止，水洗。（3）復染：第三液（呂氏美藍復染液）復染30 s，水洗。自然干燥后鏡檢?？顾釛U菌染成紅色，非抗酸桿菌為藍色。

1.2.4 結核桿菌細菌培養(yǎng) （1）前處理：視標本性狀，加1～2倍體積4%氫氧化鈉（NaOH）消化液于標本瓶中，渦旋振蕩器振蕩2～3 min，使標本充分勻化，室溫放置。（2）接種：吸取經前處理后的標本0.1 mL，均勻接種在整個培養(yǎng)基斜面。每份標本接種兩支酸性羅氏培養(yǎng)基。接種后，37℃平臥放置斜面24 h。然后擰緊培養(yǎng)瓶蓋或塞緊試管膠塞，直立放置，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。（3）結果與報告：接種后第3天、第7天各觀察1次。3 d發(fā)現(xiàn)菌落生長者，經抗酸染色證實后，可報告快速生長抗酸桿菌。以后每周觀察1次，記錄菌落生長及污染情況。陽性生長物經抗酸染色證實后，可報告抗酸桿菌生長。培養(yǎng)陰性結果須在滿8周時即第9周開始時仍未見菌落者方可報告。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件包進行統(tǒng)計學處理。不同檢測方法陽性率的比較采用卡方檢驗。

2 結果

細針穿刺細胞學（（Fine needle aspiration cytology，F(xiàn)NAC）診斷結核的主要依據是涂片中找到干酪樣壞死物、朗罕細胞和類上皮細胞，若三者同時見于淋巴結穿刺涂片，即可診斷淋巴結結核[2]。本組162例，F(xiàn)NAC直接診斷淋巴結結核61例，占37.7%，其它101例可見肉芽腫性病變或壞死性病變，診斷為可疑結核或不排除結核，進一步病原學檢查陽性和/（或）伴有肺部病灶、PPD實驗陽性及抗結核治療有效。

162例穿刺涂片抗酸染色，涂片通過1000倍油鏡仔細查找，發(fā)現(xiàn)染成紫紅色棒狀，彎曲桿狀細菌為陽性，見圖3，抗酸桿菌可散在數(shù)條或小簇散布。162例抗酸染色陽性71例，陽性率43.8%。穿刺物PCR擴增結核分枝桿菌TB—DNA，電腦自動判讀結果，陽性病例可見擴增曲線見圖4，TB—DNA陽性117例，陽性率為72.2%。結核桿菌培養(yǎng)需特殊培養(yǎng)基，菌落生長似奶酪，見圖5。細菌培養(yǎng)陽性99例，陽性率為61.1%。各項病原學檢測結果與FNAC診斷結果的對比見表1。

表1 162例結核FNAC診斷與抗酸染色、細菌培養(yǎng)、PCR檢測結果的比較

可見在FNAC明確診斷的病例，PCR及細菌培養(yǎng)陽性率明顯高于抗酸染色（χ2值均為13.739，P < 0.01），在101例FNAC未直接診斷結核的病例，PCR陽性率高于細菌培養(yǎng)及抗酸染色（χ2值分別為6.706、13.612，P均<0.01）。另外71例涂片找到抗酸桿菌的病例細菌培養(yǎng)及PCR結果均陽性，而99例細菌培養(yǎng)陽性的病例TB—DNA均陽性。FNAC直接診斷淋巴結結核的61例，占37.7%，F(xiàn)NAC結合PCR結果可明確診斷結核的為131例，占80.9%。

根據FNAC鏡下所見可分為增殖型：呈肉芽腫樣改變，可見小巢和散在杵狀、黃瓜狀上皮樣細胞和/（或）郎罕細胞（圖1）。有反應性淋巴細胞，未見干酪樣壞死組織；增殖伴壞死型：在增殖型涂片基礎上可見不同數(shù)量淡染嗜伊紅的無定形物質；干酪樣壞死型：見大量淡染嗜伊紅的壞死組織或水樣壞死無定形物（圖2）。背景中可見殘存的淋巴細胞，伴發(fā)感染時可見多量中性粒細胞。其各項病原學檢測結果見表2。從表2可見抗酸染色，細菌培養(yǎng)及PCR檢測結果陽性率在沒有壞死的增殖型明顯低于壞死型及伴有壞死的增殖型（χ2值分別為6.786，13.183，13.739，P均 < 0.01），而三者陽性率在增殖壞死型及干酪樣壞死型間無明顯差異（χ2值分別為2.973，2.981，3.001，P均>0.05）。

表2 FNAC分型與抗酸染色、細菌培養(yǎng)、PCR檢測結果的關系[n（%）]

3 討論

由于人類艾滋病病毒和耐藥結核菌株的產生等原因，全球結核病疫情明顯上升并呈持續(xù)上升趨勢[3]。世界衛(wèi)生組織于2006年發(fā)起防治結核病全球計劃。我們的實驗旨在探索一種簡便有效的淋巴結結核的確診方法。

細針穿刺細胞學（FNAC）是近年發(fā)展迅速的一種簡便、安全、快速的診斷方法，克服了外科取活檢組織損傷大，傷口不易愈合，還可能形成竇道，瘺等后遺癥的缺點。Balaji等[4]認為FNAC診斷淋巴結結核的準確性接近活檢。我們的數(shù)據顯示，162例淋巴結結核通過FNAC能直接確診的為61例，其余101例診斷為可疑結核或不排除結核，一般情況下需進一步提供病原性依據，才可進行正規(guī)抗結核治療。我們的結果還顯示，在FNAC明確診斷的病例，PCR及細菌培養(yǎng)陽性率明顯高于抗酸染色（χ2均為13.739，P < 0.01），在FNAC未直接診斷結核的病例，PCR陽性率高于細菌培養(yǎng)及抗酸染色（χ2分別為6.706、13.612，P均 < 0.01 ）。另外抗酸染色及細菌培養(yǎng)陽性的病例TB—DNA均陽性，只要FNAC結合PCR可明確診斷80.9%結核，這與相關報道一致。

Honore—Bouakline等[5]認為肺外結核細菌含量通常較少，抗酸染色和細菌培養(yǎng)假陰性較高。Tiwari等[6]發(fā)現(xiàn)送檢材料細菌含量在（10000～100000）/mL時，涂片上才能檢到細菌。文獻報道細針穿刺涂片抗酸桿菌檢出率在0～77.8%，我們的結果與Mirza等[7]的42%接近。細菌培養(yǎng)的陽性率也報道不一，Pahwa等[8]的結果僅為22%，我們的結果與Mittal等[9]的60%接近。因為聚合酶鏈反應（PCR）檢測的是結核分枝桿菌染色體特異的DNA片段，不受各種分枝桿菌菌種的影響，它可在短時間內將極微量靶DNA特異地擴增百萬倍以上，大大提高對DNA的檢出能力，所以即使18例培養(yǎng)陰性的病例PCR結果仍陽性，并且抗酸染色和培養(yǎng)陽性的病例PCR無一陰性，可見PCR結果的高效性和敏感性。本組數(shù)據仍有44例PCR結果陰性，分析可能的原因為本組病例有23例服用或服用過抗結核藥物，細菌大部分已消滅，另外穿刺時出血明顯或穿刺物位于壞死中心部位可干擾DNA的提取以及增殖型病例細菌被殺滅等。

我們的結果還顯示，抗酸染色、細菌培養(yǎng)及PCR結果均與FNAC的分型相關， 17例增殖型僅有2例PCR結果陽性，抗酸染色和細菌培養(yǎng)無一例陽性，這與該型細菌量少、毒力低而人體免疫力強，細菌在結核結節(jié)形成過程中被清除有關，與結核病的基本病理變化相吻合。

相關報道對淋巴結結核的診斷方法已做比較[1，9—11]。我們認為FNAC是診斷淋巴結結核安全有效的方法，同時還為生物學材料的獲取提供一種簡便途徑；涂片抗酸染色是廉價簡便的方法，但敏感性稍低；細菌培養(yǎng)曾被認為是金標準，但費時費力，假陰性率仍較高； PCR擴增高效、快速、敏感、特異，可作為FNAC診斷結核很好的補充。

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（收稿日期：2012—05—24）