摘要：為了比較生物檢測法和熒光光度法檢測河豚毒素（ＴＴＸ）的性能，使用昆明系小鼠與熒光光度法同時(shí)檢測１０份織紋螺（Ｎａｓｓａｒｉｕｓ ｓｅｍｉｐｌｉｃａｔｕｓ）中河豚毒素的含量。結(jié)果表明，熒光光度法與生物檢測法之間具有較好的相關(guān)性。小鼠死亡時(shí)間的倒數(shù)與ＴＴＸ的注射量間的線性方程為ｙ＝０．００６ ９７ｘ＋０．００３ ６８，ｒ＝０．９９５，精密度為７．４％～１０．９％，回收率為９０．５％。熒光光度法中ＴＴＸ的濃度與熒光強(qiáng)度間的線性方程為ｙ＝３１８．０９ｘ＋８．６０，ｒ＝０．９９９，精密度為３．１％～６．６％，回收率為９８．７％。熒光光度法測定結(jié)果穩(wěn)定，受外界因素影響小，且速度快，靈敏度高，在河豚毒素的定量檢測及預(yù)防河豚毒素中毒方面有廣泛的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：織紋螺（Ｎａｓｓａｒｉｕｓ ｓｅｍｉｐｌｉｃａｔｕｓ）；河豚毒素；熒光分光光度法；小鼠生物檢測法

中圖分類號(hào)：Ｓ９６５．２２５；Ｏ６５７．３４ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）07－1450-03

Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ Ｂｉｏａｓｓａｙ Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ in Ｄｅｔｅｒｍｉｎing Ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ

ＺＨＥＮＧ Ｄｉａｎ－ｙｕａｎ，ＸＩＡ Ｙｉ－ｙｉ，ＤＩＮＧ Ｚｈａｎ－ｐｉｎｇ

（Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ Teacher’s Ｃｏｌｌｅｇｅ / Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ Ｋｅｙ Ｌａｂ ｏｆ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ ２２２００６， Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： For comparising the performance of bioassay method and fluorescence spectrophotometry in determining tetrodotoxin（TTX）， the ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＴＴＸ ｉｎ 10 Ｎａｓｓａｒｉｕｓ ｓｅｍｉｐｌｉｃａｔｕｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｂｉｏａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ ｗａｓ ｒｅｍａｒｋａｂｌｙ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｂｉｏａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄ． Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｙ＝０．００６ ９７ｘ＋０．００３ ６８， ｒ ｗａｓ ０．９９５， ｔｈｅ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｉｏａｓｓａｙ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｆｒｏｍ ７．４％ ｔｏ １０．９％， ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９０．５％． Ｔｈｅ ｌｉｎｅａｒ ｅｑｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ ｗａｓ ｙ＝３１８．０９ｘ＋８．６０， ｒ ｗａｓ ０．９９９， ｔｈｅ ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ ｗａｓ ｆｒｏｍ ３．１％ ｔｏ ６．６％， ａｎｄ ｒｅｃｏｖｅｒｙ ｗａｓ ９８．７％． Ａｓ ｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ was ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ， ｉｔ ｗｏｕｌｄ ｐｌａｙ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｌｙ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ ｆｒｏｍ ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Ｎａｓｓａｒｉｕｓ ｓｅｍｉｐｌｉｃａｔｕｓ； ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ； ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｒｙ； mice ｂｉｏａｓｓａｙ method

河豚毒素（ｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ，ＴＴＸ）是一種劇毒的生物堿類天然神經(jīng)毒素，為典型的神經(jīng)通道阻斷劑［１］，主要作用于肌肉神經(jīng)生理活動(dòng)［２］，由于該藥具有相當(dāng)強(qiáng)的鎮(zhèn)痛作用，不產(chǎn)生耐藥性［３］，因此極有可能成為新的局部麻醉藥和戒除藥物依賴性的藥物。目前市場上的河豚毒素主要從河豚魚的卵巢和肝臟組織中提取，另外織紋螺（Ｎａｓｓａｒｉｕｓ ｓｅｍｉｐｌｉｃａｔｕｓ）等貝類也出現(xiàn)了季節(jié)性富集ＴＴＸ［４，５］，從而拓展了河豚毒素的來源，另一方面也對(duì)海產(chǎn)品帶來了安全風(fēng)險(xiǎn)［６－８］，因此對(duì)海產(chǎn)品中的ＴＴＸ的檢測，對(duì)于漁業(yè)生產(chǎn)及新藥開發(fā)都有重要意義。

ＴＴＸ的檢測主要有生物檢測法、氣相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法、液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用法、毛細(xì)管電泳法等［８－１０］。由于小鼠生物測定法具有快速、簡單的特點(diǎn)，成為目前檢測ＴＴＸ的主要方法，但由于小鼠個(gè)體差異，結(jié)果準(zhǔn)確性較差，同時(shí)小鼠對(duì)ＴＴＸ缺乏特異性。熒光光度法特異性相對(duì)較強(qiáng)，誤差較小，但來自樣品的熒光物質(zhì)也有干擾，因此在實(shí)際應(yīng)用中各有利弊。對(duì)兩種方法的比較研究，國內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道，我們應(yīng)用小鼠生物測定法和熒光光度法分別對(duì)ＴＴＸ進(jìn)行檢測，從而為海產(chǎn)品中ＴＴＸ的檢測提供理論基礎(chǔ)。

１ 材料與方法

１．１ 儀器與試劑

９７０ＣＲＴ型熒光分光光度計(jì)（上海分析儀器總廠），ＰＨＳ－３Ｃ型數(shù)字型酸度計(jì)（上海理達(dá)儀器廠）。河豚毒素標(biāo)準(zhǔn)品（河北省水產(chǎn)公司）；Ｔｒｉｓ、ＮａＣｌ、ＮａＯＨ（上海國藥集團(tuán)）。以上試劑除說明外均為分析純。實(shí)驗(yàn)使用去離子水，使用前檢查確定不含熒光雜質(zhì)。

１．２ 小鼠生物檢測法

依據(jù)日本官方檢測河豚毒素的小鼠生物檢測法， 采用目前通用的小鼠單位（ＭＵ）定義：３０ ｍｉｎ 內(nèi)殺死１只２０ ｇ左右雄性ｄｄｙ品系的小鼠毒素量（１ ＭＵ＝０．２２ μｇ ＴＴＸ）［９］。腹腔注射小鼠， 觀察小鼠的藥物反應(yīng)， 必須出現(xiàn)河豚毒素中毒的典型癥狀， 停止呼吸作為判斷死亡的標(biāo)準(zhǔn)。由于ｄｄｙ小鼠不易獲得，本試驗(yàn)采用昆明ＩＣＲ小鼠［１１］。

１．３ 熒光分光光度法

ＴＴＸ在堿性條件下加熱生成２－羥基－６－羥甲基－８－羥基喹唑琳（也稱Ｃ９堿），Ｃ９堿在３７０ ｎｍ激發(fā)，于４９５ ｎｍ處出現(xiàn)特征峰，熒光強(qiáng)度反映ＴＴＸ的含量。激發(fā)狹縫為１０ ｎｍ，發(fā)射狹縫２０ ｎｍ。速度為５００ ｎｍ／ｍｉｎ。

１．４ 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

１．４．１ 小鼠生物檢測法 ?。?ｍｇ ＴＴＸ標(biāo)準(zhǔn)品溶解于１０ ｍＬ容量瓶中， 制得濃度為０．１ ｍｇ／ｍＬ的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，分 別 吸 ?。埃埃常?、０．０３５、０．０４０、０．０４５、０．０５０、０．０５５、０．０６０、０．０６５ｍｌ 儲(chǔ)備液稀釋至 １０ ｍL， 濃度范圍為３００～６５０ ｍｇ／ｍＬ，每個(gè)濃度取 ４ 個(gè)平行，分別腹腔注射 １９．５～２０．５ ｇ 體重的昆明 ＩＣＲ 品系雄性小鼠， 注射劑量為 １ ｍＬ，記錄死亡情況及時(shí)間。根據(jù)死亡時(shí)間倒數(shù)與小鼠單位體重河豚毒素注射劑量繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

１．４．２ 熒光分光光度計(jì)法［１２］ 溶液配制：２０ μｇ／ｍＬ ＴＴＸ儲(chǔ)備液：?。?ｍｇ ＴＴＸ標(biāo)準(zhǔn)品溶解于１ ｍＬ重蒸水中，取２００ μＬ 定容至１０ ｍＬ；１６ ｍｏｌ／ｍＬ ＮａＯＨ儲(chǔ)備液：?。保?ｇ ＮａＯＨ 加水溶解，用水定容至２５ ｍＬ；Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩沖液：?。玻矗?ｇ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ （ｐＨ ７．４）、５．８５ ｇ ＮａＣｌ、０．４７５ ｇ ＭｇＣｌ２、加水溶解，用水定容至１０００ ｍＬ； ０．０１～１．７ μｇ／ｍＬ ＴＴＸ堿解體系。

１．５ 河豚毒素的檢測及回收試驗(yàn)

采用乙酸法提?。裕裕?，織紋螺經(jīng)水洗后，去殼，取螺肉１０ ｇ，搗碎后與１００ ｍＬ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＨＡｃ充分混合［１３］，再煮沸１０ ｍｉｎ，調(diào)節(jié)ｐＨ至３．０，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ離心１０ ｍｉｎ，取上清液，沉淀物用上述方法再提?。泊?，合并濾液，減壓濃縮，再用氯仿抽提。濃縮液中再加入１０％的苦味酸，經(jīng)煮沸后立即過濾，冷卻后結(jié)晶出ＴＴＸ的苦味酸鹽，晶體再用熱水溶解，氨水調(diào)節(jié)ｐＨ至９．０，冷卻后過濾，將沉淀用水洗滌，再溶于０．１ ｍｏｌ／Ｌ ＨＡｃ中備用。四角蛤蜊（Ｍａｃｔｒａ ｖｅｎｅｒｉｆｏｒｍｉｓ）中添加一定量的ＴＴＸ，用上述方法進(jìn)行添加回收試驗(yàn)。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 生物測定法

２．１．１ 生物測定法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 結(jié)果如圖１所示，線性方程為ｙ＝０．００６ ９７ｘ＋０．００３ ６８，ｒ＝０．９９５。自然界中尚存在諸如ＰＳＰ等貝類毒素也可使小鼠出現(xiàn)ＴＴＸ中毒的類似癥狀， 因此小鼠檢測有誤差干擾。同時(shí)不同個(gè)體的生理狀況的差異也影響到檢測的準(zhǔn)確性。另外， 小鼠生物測定法檢測限較高， 本試驗(yàn)檢出限為０．２ μｇ／ｍＬ，其中以小鼠死亡時(shí)間６～８ ｍｉｎ相對(duì)準(zhǔn)確，也影響該方法對(duì)微量ＴＴＸ的檢測。

２．１．２ 小鼠生物測定法的精密度及加標(biāo)回收試驗(yàn) 分別給小鼠注射低、中、高３個(gè)濃度（３００、５００、６５０ ｎｇ／ｍＬ）的ＴＴＸ，按照試驗(yàn)方法進(jìn)行操作，在１ ｄ內(nèi)分別測定５份樣品的ＴＴＸ，計(jì)算日內(nèi)精密度。每天各測定一份樣品連續(xù)測定５ ｄ（ｎ＝３），計(jì)算日間精密度。以四角蛤蜊為材料，開展低、中、高３個(gè)濃度（３００、５００、６５０ ｎｇ／ｍＬ）的添加回收試驗(yàn)。結(jié)果見表１。

２．２ 熒光光度法測定結(jié)果

２．２．１ 熒光光度法標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖２所示，線性方程為ｙ＝３１８．０９x＋８．６０， ｒ＝０．９９９，ｎ＝３，線性范圍為０．０３～１．７０ μｇ／ｍＬ，檢測限為０．０１５ μｇ／ｍＬ。

２．２．２ 熒光光度法的穩(wěn)定性測試 配制濃度為０．５ μｇ／ｍＬ的ＴＴＸ堿解體系，按照上述實(shí)驗(yàn)方法操作，放置０、３０、６０、９０、１２０ ｍｉｎ測定熒光強(qiáng)度，結(jié)果表明，在２ ｈ內(nèi)熒光強(qiáng)度穩(wěn)定。但反應(yīng)體系在氙燈照射下，熒光強(qiáng)度在１５ ｍｉｎ后迅速下降。試驗(yàn)應(yīng)在１５ ｍｉｎ內(nèi)完成，此時(shí)的誤差小于５％。

２．２．３ 熒光分光光度計(jì)法精密度及加標(biāo)回收試驗(yàn) 平行配制低、中、高３個(gè)濃度（０．０５、０．７０、１．３０ μｇ／ｍＬ）的ＴＴＸ堿解體系，按照上述方法，在１ ｄ內(nèi)分別測定５份樣品熒光強(qiáng)度，計(jì)算日內(nèi)精密度。每天各測定一份樣品連續(xù)測定５ ｄ，計(jì)算日間精密度（ｎ＝３），以四角蛤蜊為材料，開展低、中、高３個(gè)濃度（０．０５，０．７，１．３ μｇ／ｍＬ）的ＴＴＸ堿解體系，測定回收率，結(jié)果見表２。

２．３ 方法比較

２．３．１ 方法相關(guān)性檢驗(yàn) 對(duì)上述２種方法檢測ＴＴＸ標(biāo)準(zhǔn)溶液結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，得到的回歸方程為ｙ＝２３．０９０ｘ－２７４．０６２，ｒ=０．９９６，Ｆ＝１１３１．８２８，P０．００１＜０．０１。說明用小鼠生物測定和熒光光度計(jì)法檢測ＴＴＸ標(biāo)準(zhǔn)溶液呈極顯著相關(guān)。

２．３．２ 結(jié)果相關(guān)性檢驗(yàn) 對(duì)２種方法檢測織蚊螺提取液的結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)，１０份不同織紋螺樣品分別用小鼠生物測定法和熒光光度法進(jìn)行檢測，結(jié)果見表３。

得到的線性方程為ｙ＝０．５３５ｘ＋６．７３４，ｒ=０．７１６，Ｆ＝８．４３０，P＝０．０２０＜０．０５。說明用生物測定法和熒光光度法檢測樣品ＴＴＸ呈顯著相關(guān)。熒光光度法檢測值高于生物測定法，其原因是：①樣品提取液中可能存在著一些使檢測結(jié)果偏高的熒光物質(zhì)［１４］，如蛋白質(zhì)；②織紋螺提取液中存在一定量的河豚毒素衍生物，如河豚酸（ｔｅｔｒｏｄｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、４－表河豚毒素（４－ｅｐｉｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ）、脫水河豚毒素（ａｎｈｙｄｒｏｔｅｔｒｏｄｏｔｏｘｉｎ）等［１５］，它們可以產(chǎn)生熒光物質(zhì)，但它們的毒力要遠(yuǎn)低于河豚毒素甚至無毒［１６］。

熒光光度法的精密度及回收率都大于小鼠生物檢測法，由于是平行試驗(yàn)，提取方法引起的誤差相對(duì)較小，因此精密度的差別主要是由于小鼠個(gè)體差異引起的。同樣，回收率的差別也可歸于小鼠個(gè)體差異。因此小鼠生物測定法測定ＴＴＸ過程中，應(yīng)選擇生理狀態(tài)一致的個(gè)體，同時(shí)應(yīng)進(jìn)行個(gè)體重量校正，以最大程度減小試驗(yàn)誤差。

３ 小結(jié)與討論

小鼠生物檢測法與熒光光度法檢測樣品中的ＴＴＸ的含量都有較高的準(zhǔn)確性，但前者易受其他毒素［１７］及小鼠個(gè)體間差異的影響，后者對(duì)檢測物中ＴＴＸ的純度要求高，易受檢測物中熒光雜質(zhì)的影響。２種方法有較好的相關(guān)性，可以根據(jù)實(shí)際情況及對(duì)樣品檢測限要求的不同采用不同的方法。

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