摘要：建立了漆姑草（Ｓａｇｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ）中蘆丁和槲皮素含量的反相高效液相色譜—二極管陣列檢測(cè)法，采用乙醇—超聲波提取， 以Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ ＶＰ－ＯＤＳ（２００ ｍｍ×４．６ ｍｍ）為色譜柱， 以甲醇∶水（含０．２％磷酸）＝６０∶４０（Ｖ／Ｖ）為流動(dòng)相， 流速為０．８ ｍＬ／ｍｉｎ， 柱溫為３０ ℃， 檢測(cè)波長(zhǎng)為２５５ ｎｍ。蘆丁和槲皮素能得到較好的分離， 分別在０．０３～１５．００ μｇ／ｍＬ（ｒ＝０．９９９ ０）和０．０４～２０．００ μｇ／ ｍＬ（ｒ＝０．９９９ ４）的濃度范圍內(nèi)與峰面積成良好線(xiàn)性關(guān)系， 檢測(cè)限分別為１２．６和１５．２ ｎｇ／ｍＬ。本方法操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好， 可用于漆姑草藥材的質(zhì)量控制，為漆姑草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：漆姑草（Ｓａｇｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ）；蘆丁；槲皮素；高效液相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào)：Ｏ６５７．７＋２ 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： Ａ 文章編號(hào)：0439－８114（２０12）07－1444-03

Contents ｏｆ Ｒｕｔｉｎ ａｎｄ Ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ｉｎ Ｓａｇｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ（Ｓｗｅｅｔ） Ｏｈｗｉ Determined ｂｙ ＨＰＬＣ

ＧＡＯ Ｚｈｉ－ｘｉ１，ＷＵ Ｙａｎ－ｈｏｎｇ１，ＬＩ Ｇａｎｇ２，ＭＵ Ｑｉｎｇ－ｓｏｎｇ１，ＬＩＵ Ｙａｎ１，ＡＯ Ｋｅ－ｈｏｕ１

（１． Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Gｕｉｚｈｏｕ Nｏｒｔｈ’ｓ Cｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ Rｅｓｏｕｒｃｅｓ Aｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ / Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｚｕｎｙｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｚｕｎｙｉ ５６３００２， Ｇｕｉｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ； ２． Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ， Ｚｕｎｙｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｚｕｎｙｉ ５６３００３， Ｇｕｉｚｈｏｕ， Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ＨＰＬＣ－ＰＤＡ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｒｕｔｉｎ ａｎｄ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ｉｎ Sａｇｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ（Sｗｅｅｔ） Oｈｗｉ， ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｒｕｔｉｎ ａｎｄ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ ｆｒｏｍ S. ｊａｐｏｎｉｃａ ｂｙ ｅｔｈａｎｏｌ ｗｉｔｈ ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ｗａｖｅ ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ． Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｏｎ Ｃ１８ （Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ ＶＰ－ＯＤＳ ２００ ｍｍ×４．６ ｍｍ） ｃｏｌｕｍｎ， ｗｉｔｈ ＭｅＯＨ ａｎｄ Ｈ２Ｏ（６０∶４０， Ｖ／Ｖ） which contained 0.2% phosphoric acid ａｓ ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ ａｔ ａ ｆｌｏｗ ｒａｔｅ ｏｆ ０．８ ｍＬ／ｍｉｎ． Ｔｈｅ ｃｏｌｕｍｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｗａｓ ３０ ℃ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ ｗａｓ ２５５ ｎｍ． Ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ method ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｎｄ ｔｈｅ ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｓｈｏｗｅｄ ｇｏｏｄ ｌｉｎｅａｒｉｔｙ ｏｖｅｒ ｔｈｅ ｒａｎｇｅ ｏｆ ０．０３～１５．００ μｇ／ｍＬ（ｒ＝０．９９９ ０）ａｎｄ ０．０４~２０．００ μｇ／ｍＬ（ｒ＝０．９９９ ４） ｆｏｒ ｒｕｔｉｎ ａｎｄ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔｓ ｗｅｒｅ １２．６ ａｎｄ １５．２ ｎｇ／ｍＬ ｆｏｒ ｒｕｔｉｎ ａｎｄ ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ｔｈｉｓ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ ｍｅｔｈｏｄ waｓ ａｃｃｕｒａｔｅ， ｒｅｌｉａｂｌｅ， ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｌｅ， ａｎｄ could ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ S. ｊａｐｏｎｉｃａ ａｎｄ it ｏｆｆｅｒed ａ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ Ｓ. ｊａｐｏｎｉｃａ ｓｔａｎｄａｒｄｓ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： Sａｇｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ（ｓｗｅｅｔ） ｏｈｗｉ； ｒｕｔｉｎ； ｑｕｅｒｃｅｔｉｎ； ＲＰ－ＨＰＬＣ

漆姑草（Ｓａｇｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ（Ｓｗｅｅｔ）Ｏｈｗｉ），又名牛毛粘、蛇牙草、大龍葉、蝦子草、大龍草等，為石竹科植物漆姑草的全草。分布于江蘇、四川、湖南、湖北、貴州、云南等地。該藥常用于治療漆瘡、禿瘡、濕疹、丹毒、瘰疬、無(wú)名腫毒、毒蛇咬傷、齲齒痛、跌打內(nèi)傷等［１］。漆姑草味苦，性涼，有散結(jié)消腫，解毒止癢之功效［２］。研究表明，漆姑草中含有黃酮類(lèi)成分［３］。分析漆姑草中的蘆丁和槲皮素含量對(duì)漆姑草的藥物開(kāi)發(fā)應(yīng)用具有重要意義。

黃酮類(lèi)物質(zhì)對(duì)人體健康有重要作用，因其在抗氧化、清除自由基以及對(duì)過(guò)敏、感染、高血壓、腫瘤等疾病治療方面的積極作用，受到研究者的重視［４］。黃酮的分析方法有分光光度法［５－７］、熒光法［８，９］、電化學(xué)分析法［１０，１１］等，目前分析測(cè)定蘆丁和槲皮素使用最廣泛的是高效液相色譜法［１２－１５］。但用反相高效液相色譜—二極管陣列檢測(cè)法（ＲＰ－ＨＰＬＣ－ＰＤＡ）測(cè)定漆姑草中黃酮類(lèi)化合物尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)漆姑草中蘆丁和槲皮素進(jìn)行了分離與測(cè)定，方法簡(jiǎn)便可行、重現(xiàn)性好。

１ 材料與方法

１．１ 儀器和試劑

Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ－２０１０ＡＴ型高效液相色譜儀，ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ二極管陣列檢測(cè)器（日本島津公司）；ＳＹ３２００超聲波清洗器（上海聲源超聲波儀器設(shè)備有限公司）；ＲＥ－５２９９旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司）；ＤＨＧ－９０７０Ａ型新型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（寧波江南儀器廠）；自制索式提取器；植物粉碎機(jī)（２０～１２０目）；８００型離心沉淀器（上海手術(shù)器械廠）；微孔過(guò)濾裝置。

蘆丁和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品（９８％）均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品批號(hào)：Ｆ２００９０７０２；槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品批號(hào)：Ｆ２００９０２２５；乙腈（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），甲醇（分析純，遵義師范學(xué)院試劑廠），鹽酸（ＡＲ）、Ｈ２ＳＯ４（ＡＲ）、石灰水（自制）、脫脂棉、無(wú)水乙醇（徐州試劑二廠），石油醚（上海試劑一廠）。所有溶液使用前均由０．４５ μｍ孔徑的濾膜過(guò)濾。

收集了不同產(chǎn)地漆姑草藥材。經(jīng)遵義醫(yī)學(xué)院黎剛老師鑒定為石竹科植物漆姑草（Ｓａｇｉｎａ ｊａｐｏｎｉｃａ （Ｓｗｅｅｔ）Ｏｈｗｉ）的全草。

１．２ 色譜條件

色譜柱：Ｓｈｉｍ－ｐａｃｋ ＶＰ－ＯＤＳ（２００ ｍｍ×４．６ ｍｍ）。流動(dòng)相為甲醇∶水（含０．２％磷酸）＝ ６０∶４０（Ｖ／Ｖ），用前經(jīng)０．４５ μｍ 濾膜過(guò)濾，流速 ０．８ ｍＬ／ｍｉｎ；柱溫３０ ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)２５５ ｎｍ；進(jìn)樣量２０ μＬ。

１．３ 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱(chēng)取０．０１０ ０ ｇ蘆丁和槲皮素， 用甲醇（分析純）溶解，超聲振蕩１５ ｍｉｎ，放置至室溫用甲醇并定容至５０ ｍＬ，搖勻備用。吸取已配制好的標(biāo)準(zhǔn)溶液來(lái)配制一系列不同濃度溶液分別進(jìn)樣。所有溶液使用前均由０．４５ μｍ孔徑的濾膜過(guò)濾。

１．４ 樣品前處理

將購(gòu)買(mǎi)的漆姑草分別用粉碎機(jī)粉碎，４０目過(guò)篩后，放在烘箱中于６５ ℃烘１０ ｈ。準(zhǔn)確稱(chēng)?。矗?ｇ漆姑草粉末置于索氏浸提管中，高度不超過(guò)虹吸管，以石油醚為脫脂劑于４５ ℃水浴鍋中脫脂２０ ｈ。充分除去樣品中脂類(lèi)和脂溶性色素后，將濾紙包取出，先用電吹風(fēng)吹干。再置于干燥箱６５ ℃烘２ ｈ后。置于１００ ｍＬ三角燒瓶中，待下一步制備［１６］。

１．５ 樣品溶液的制備

稱(chēng)取脫脂的漆姑草粉末１０．００ ｇ，置入超聲破碎儀，加入２００ ｍＬ ７０％乙醇，超聲破碎處理３０ ｍｉｎ，超聲頻率為２０ ｋＨｚ，每工作７ ｓ暫停３ ｓ，溫度設(shè)置為２５ ℃。抽濾，濾液減壓濃縮，冷凍干燥，得粗提物［１６］。

準(zhǔn)確稱(chēng)取樣品適量，甲醇溶解完全后轉(zhuǎn)入５０ ｍＬ容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，得到供試品溶液。

２ 結(jié)果與分析

２．１ 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)ＳＰＤ－Ｍ２０Ａ二極管陣列檢測(cè)器對(duì)蘆丁和槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行在線(xiàn)掃描，得到化合物蘆丁和槲皮素的紫外吸收光譜。結(jié)果表明槲皮素在２５５ ｎｍ 和３７２ ｎｍ 處均有較強(qiáng)吸收，蘆丁在２５６ ｎｍ 和３５５ ｎｍ 處有較強(qiáng)吸收。通過(guò)試驗(yàn)在２５５ ｎｍ 處各物質(zhì)能取得較強(qiáng)吸收， 故選擇測(cè)定波長(zhǎng)為２５５ ｎｍ。在該波長(zhǎng)下進(jìn)行測(cè)定，既保證了較高的分析靈敏度，又無(wú)干擾。

２．２ 流動(dòng)相的選擇

黃酮類(lèi)物質(zhì)都微溶于水，而溶于有機(jī)溶劑，分別以乙腈／離子對(duì)溶液、乙腈／水、甲醇／離子對(duì)溶液和甲醇／水體系作流動(dòng)相，對(duì)蘆丁和槲皮素及其雜質(zhì)的分離效果進(jìn)行考察，當(dāng)選用甲醇－水溶液作溶劑時(shí)分離效果最佳。當(dāng)甲醇∶水＞７０∶３０（Ｖ／Ｖ）時(shí)，分離效果不好；當(dāng)甲醇∶水＜５０∶５０（Ｖ／Ｖ）時(shí)，分析時(shí)間明顯增長(zhǎng)，峰形擴(kuò)展嚴(yán)重。而在甲醇∶水＝６０∶４０（Ｖ／Ｖ）時(shí)，能取得較好的分離效果，但是色譜峰稍有拖尾現(xiàn)象，通過(guò)加入０．２％的磷酸溶液能消除峰拖尾， 本試驗(yàn)選擇甲醇∶水（０．２％磷酸）＝６０∶４０（Ｖ／Ｖ）作為流動(dòng)相。

２．３ 流速的選擇

隨流速增加，各峰的保留時(shí)間均減少，流速在０．３～０．８ ｍＬ／ｍｉｎ均能很好分離，但流速在０．５ ｍＬ／ｍｉｎ以下時(shí)，色譜峰逐漸擴(kuò)展，檢測(cè)靈敏度下降。流速在０．８ ｍＬ／ｍｉｎ以上時(shí)，蘆丁峰與相鄰峰重疊，分離度下降。在一定波長(zhǎng)、流動(dòng)相的條件下，分別測(cè)定了不同流速時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)蘆丁和槲皮素，發(fā)現(xiàn)以流速為０．８ ｍＬ／ｍｉｎ時(shí)，蘆丁和槲皮素與雜質(zhì)分離完全、峰形對(duì)稱(chēng)。本試驗(yàn)選擇實(shí)驗(yàn)進(jìn)樣流速為０．８ ｍＬ／ｍｉｎ。

２．４ 線(xiàn)性范圍及檢出限

在上述色譜條件下，測(cè)定不同濃度的蘆丁和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，以溶液濃度（ｘ）與峰面積（ｙ）作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。蘆丁和槲皮素分別在０．０３～１５．００ μｇ／ ｍＬ、０．０４～２０．００ μｇ／ ｍＬ范圍內(nèi)，濃度（ｘ）與峰面積（ｙ）有很好的相關(guān)性，回歸方程為ｙ＝６．９１５×１０４ｘ＋２．０６３×１０３、ｙ＝ ８．９８９×１０４ｘ＋１１５．２００，相關(guān)系數(shù)分別為０．９９９ ０和０．９９９ ４，能夠滿(mǎn)足定量分析的要求。檢出限分別為１２．６和１５．２ ｎｇ／ｍＬ。蘆丁和槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見(jiàn)圖１。

２．５ 藥材的提取方法實(shí)驗(yàn)

取貴州產(chǎn)漆姑草按照３種不同方法制備的供試品溶液，分別進(jìn)樣２０ μＬ，測(cè)定蘆丁和槲皮素含量（ｎ＝５），測(cè)定平均值，采用水法提取、索氏法提取、乙醇－超聲波輔助法提取的蘆丁和槲皮素含量如表１。

２．６ 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批漆姑草藥材粉末６份，按１．５制備方法進(jìn)行制備，平行測(cè)定，以蘆丁和槲皮素的含量為指標(biāo)，ＲＳＤ為２．２３％和２．１４％，表明方法重現(xiàn)性良好。

２．７ 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取供試品溶液，分別于０、２、４、８、１２、２４ ｈ測(cè)定，結(jié)果蘆丁和槲皮素峰面積的ＲＳＤ為１．６４％和２．０１％，說(shuō)明供試品溶液２４ ｈ內(nèi)穩(wěn)定性良好。

２．８ 方法的精密度和回收率

在選定的色譜條件下進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，漆姑草樣品分別以０．０１、０．０５、０．１０ ｍｇ／ｋｇ ３個(gè)添加水平，按照樣品處理方法進(jìn)行提取、凈化，測(cè)定蘆丁和槲皮素含量，計(jì)算回收率。貴州產(chǎn)漆姑草樣中蘆丁和槲皮素添加回收率在９２．６％～９９．５％，ＲＳＤ（ｎ＝３）為１．７０％～２．７７％，方法的回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差符合國(guó)內(nèi)外有關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。因此，本方法具有很高的靈敏度與精密度，重現(xiàn)性好、回收率穩(wěn)定，可以為漆姑草樣品中蘆丁和槲皮素的測(cè)定提供參考。

２．９ 樣品測(cè)定

對(duì)不同產(chǎn)地的漆姑草樣品中的蘆丁和槲皮素進(jìn)行測(cè)定，漆姑草樣品色譜圖見(jiàn)圖２，結(jié)果見(jiàn)表２。

３ 結(jié)論

本文建立了漆姑草中蘆丁和槲皮素的ＨＰＬＣ－ＰＤＡ含量分析的方法。研究結(jié)果表明，該方法檢出限低、重現(xiàn)性好、精密度高，并且操作簡(jiǎn)便、快速。

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