摘要:用水超聲法提取紅花(Carthamus tinctorius L.)中紅花黃色素A,提取液經(jīng)D-101大孔吸附樹脂色譜柱進(jìn)行粗分,所得水及體積分?jǐn)?shù)30%的乙醇洗脫物用中壓制備色譜進(jìn)行兩次分離純化,所得產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜分析,羥基紅花黃色素A純度為95.968%。該方法省時(shí)、簡(jiǎn)便、高效,值得推廣應(yīng)用。
關(guān)鍵詞:紅花(Carthamus tinctorius L.);中壓制備色譜;大孔吸附樹脂;羥基紅花黃色素A
中圖分類號(hào):R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2012)07-1441-03
Separation of Hydroxysafflor Yellow A from Safflower by Medium Pressure Column Chromatography with Macroporous Resin
WU Yong-gang,LI Xue-ying
(Department of Acupuncture, Message, Recovery and Health Care, Shandong College of Traditional Chinese Medicine, Yantai 264199, Shandong, China)
Abstract: Hydroxysafflor yellow A (HSYA) craft extract was obtained by water-ultrasonic method from safflower (Carthamus tinctorius L.) and then seperated by D-101 macroporous resin chromatography. The water and 30% ethanol elution was purified by medium pressure column chromatograph for twice. According to HPLC results, the purity of HSYA prepared could be up to 95.986%. This mechod was time saving, convenient, efficient, and propagable.
Key words: safflower(Carthamus tinctorius L.); medium pressure column chromatography; macroporous resin; hydroxysafflor yellow A(HSYA)
紅花為菊科植物紅花(Carthamus tinctorius L.)的干燥管狀花,為活血化瘀的主要中藥之一,用于治療冠心病、腦血栓等心腦血管疾?。郏?,2]。紅花的主要活性成分是紅花黃色素(Safflower yellow,SY),其是一種復(fù)雜的水溶性混合物,其結(jié)構(gòu)中含有特殊的醌式查爾酮的結(jié)構(gòu)骨架,一直是紅花化學(xué)成分研究的重點(diǎn)[3]。SY中含量較高的是羥基紅花黃色素A(Hydroxysafflor yellow A,HSYA),占SY的50%左右。HSYA是具有單查爾酮苷類結(jié)構(gòu)的化合物,被認(rèn)為是紅花活血化瘀的主要效應(yīng)物質(zhì)[4,5]。目前分離制備HSYA通常采用大孔吸附樹脂色譜法對(duì)紅花提取物進(jìn)行除雜后得HSYA粗品,Sephadex LH-20凝膠柱層析法制備HSYA純品[6,7],但這些方法不適用于快速、大規(guī)模制備HSYA。中壓制備色譜是一種快速制備色譜系統(tǒng),具有上樣量大、分離速度快、可梯度洗脫、成本低、在線檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)[8],本研究采用水提取和大孔吸附樹脂柱色譜得到粗提物,以此粗提物直接進(jìn)行中壓制備色譜分離純化,經(jīng)兩步分離得到純度高于95%的HSYA,豐富了HSYA的制備技術(shù)。
1 儀器與材料
EZ Purifier III中壓制備色譜系統(tǒng)及Versatiler色譜工作站(配有二元溶劑輸送泵、UV檢測(cè)器、自動(dòng)餾分收集器,上海利穗電子科技有限公司)。色譜柱及填料:C18-AQ(GHODSB12S50,50 μm,北京綠百草科技發(fā)展有限公司),4 cm×14 cm(40 g),2根串聯(lián)。Agilent 1200型高效液相色譜儀,包括Agilent G1312B二元泵,Agilent G1379B脫氣機(jī),Agilent 1313B自動(dòng)進(jìn)樣器,Agilent 1316B柱溫箱,Agilent 1315B二極管陣列檢測(cè)器、Agilent Chemistation化學(xué)工作站。
乙腈(HPLC級(jí),德國(guó)Merck公司)、三氟乙酸(分析純,南開大學(xué)精細(xì)化學(xué)實(shí)驗(yàn)廠)、甲醇(色譜純,天津市大茂化學(xué)試劑廠)、純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司,使用前經(jīng)0.45μm水系濾膜過濾)、D-101大孔吸附樹脂(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)、羥基紅花黃色素A對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)111637-200301);紅花為菊科植物紅花(C. tinctorius L.)的干燥管狀花。
2 試驗(yàn)方法與結(jié)果
2.1 水超聲法提取HSYA
2.1.1 高效液相色譜分析條件[9-11] 色譜柱:Phenomenex C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:乙腈(A)-0.01%三氟乙酸溶液(B);洗脫程序:0~5 min:2%A(體積分?jǐn)?shù),下同);5~25 min:2%~5%A;25~35 min:5%~10%A;35~65 min:10%~20%A;65~70 min:20%A。柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm;進(jìn)樣體積:20 μL。
2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精確稱取羥基紅花黃色素A對(duì)照品15.00 mg置25 mL容量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,得0.60 mg/mL羥基紅花黃色素A對(duì)照品儲(chǔ)備液,配制成一定濃度梯度的對(duì)照品溶液,按2.1.1所述條件進(jìn)行色譜分析,以Y表示峰面積積分值,以X(mg)表示對(duì)照品進(jìn)樣量,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并計(jì)算回歸方程。其線性回歸方程為Y=26 805.00X-298.36,R2=0.999 1。
2.1.3 紅花水提取液制備 稱取紅花藥材900 g,加15倍質(zhì)量的蒸餾水超聲提?。泊?,每次45 min,過濾,合并濾液減壓濃縮至900 mL(此時(shí)提取液含生藥的濃度為1 g/mL)。加入95%的乙醇(體積分?jǐn)?shù),下同)使含醇量達(dá)到80%,醇沉24 h,濾液減壓回收至900 mL,加5倍體積的蒸餾水沉淀24 h,離心,上清液減壓濃縮至900 mL,備用。
2.2 大孔吸附樹脂柱色譜法制備粗品HSYA
取上述紅花水提液900 mL上直徑40 mm×800 mm的D-101大孔吸附樹脂色譜柱,蒸餾水洗脫的前3個(gè)體積洗脫液(3 BV)中主要是多糖、蛋白質(zhì)、鞣質(zhì)等水溶性雜質(zhì),棄去,然后依次用蒸餾水、30%的乙醇、60%的乙醇、95%的乙醇各3 BV洗脫,流速為1 mL/min,1 BV收集洗脫液約750 mL,共收集12份。
采用HPLC法測(cè)定每份洗脫液中HSYA的含量,繪制相應(yīng)的洗脫曲線(圖1)。根據(jù)洗脫曲線,合并含量高于0.04 mg/mL的第1~4份洗脫液,第5~12份洗脫液由于HSYA相對(duì)含量較少而放棄。減壓濃縮后得浸膏18.0 g,冰箱中冷凍保存,備用。
2.3 中壓制備色譜分離
為降低試驗(yàn)成本,本試驗(yàn)首先采用甲醇-水體系進(jìn)行各組分分離。精確稱取浸膏樣品2.0 g用10 mL甲醇溶解,經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾,注入ODS柱中。洗脫條件為柱溫:室溫;波長(zhǎng):280 nm;流速:20 mL/min;線性梯度洗脫程序:在60 min內(nèi),甲醇與水的體積比由0∶100變化為50∶50,中壓系統(tǒng)分析色譜如圖2,根據(jù)色譜峰情況收集洗脫液,進(jìn)行HPLC分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)峰A中HSYA含量較高,對(duì)其減壓濃縮進(jìn)行二次中壓制備。線性梯度洗脫程序:在28 min內(nèi),乙腈與水的體積比由0∶100變化為30∶70,中壓系統(tǒng)分析色譜如圖3,根據(jù)出峰情況精確收集。
2.4 產(chǎn)物的純度分析
HPLC分析各洗脫液并與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照,結(jié)果表明峰B為HSYA,其HPLC圖譜上僅一峰(圖4),由面積歸一化法算得其純度為95.968%,減壓濃縮后真空干燥得137 mg HSYA黃色粉末。
3 小結(jié)與討論
1)大孔樹脂是一類有機(jī)高聚物吸附劑,注有致孔劑,不含交換基團(tuán),含有“空隙”結(jié)構(gòu),特別適合從水溶液中分離化合物[12,13]。本試驗(yàn)用大孔樹脂法制備的紅花粗提液采用水和乙醇洗脫效果較好。
2)采用中壓制備色譜對(duì)紅花大孔樹脂粗提液進(jìn)行分離純化,單位時(shí)間獲得的化合物量大,4 h即可完成整個(gè)分離過程。分離效果好,避免了HSYA在開口柱上由于長(zhǎng)時(shí)間暴露而導(dǎo)致分解;柱填料可以自行填裝,根據(jù)所制備的HSYA極性較大的特點(diǎn),選擇C18反相填料純化;同時(shí)2根色譜柱串聯(lián)可有效提高分辨率,本試驗(yàn)連續(xù)兩次對(duì)紅花粗提液中壓色譜分離制備,第一次通過中壓柱層析分段,然后再次分離制備,取得了不錯(cuò)的效果。在中壓制備色譜分離過程中,要注意以下幾個(gè)問題[5]:①化合物要溶解于系統(tǒng)溶劑。②化合物與固定相不存在不可逆吸附。③選擇適宜的洗脫方式和流動(dòng)相比例。本研究中,先后選擇典型溶劑系統(tǒng)甲醇/水和乙腈/水進(jìn)行線性梯度洗脫,連續(xù)兩次分離制備,從盡可能低的濃度開始梯度洗脫以確保不丟失目標(biāo)物質(zhì)。
3)本試驗(yàn)采用大孔樹脂柱色譜與中壓制備色譜法結(jié)合,從紅花中直接分離得到高純度(95.968%)的HSYA。該方法簡(jiǎn)便、快速。從2.0 g粗提物中得到137 mg HSYA。值得注意的是,水洗脫除雜時(shí)應(yīng)注意在除去糖類的同時(shí)應(yīng)盡可能保留較多的HSYA,至于如何提高分離純化效率,還有待進(jìn)一步研究。
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