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        降解多菌靈木霉菌株的分離及其生防與降解特性

        2012-12-31 00:00:00鄭恩澤
        湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2012年7期

        摘要:從長(zhǎng)期施用多菌靈的葡萄園土壤中分離純化得到一株能夠降解多菌靈的木霉(Trichoderma sp.)菌株Tr1。在以多菌靈為惟一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)14 d后,該菌株對(duì)多菌靈的降解率為45.74%。在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加少量氮源,可以提高木霉Tr1對(duì)多菌靈的降解率,尤其是添加0.1%酵母粉,降解率達(dá)到了66.57%。木霉Tr1在含氮的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基上的最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃,最適初始pH為6.5。木霉Tr1還對(duì)所測(cè)定的6種植物病原真菌(Rhizoctonia solani,Phytophthora capsici,Verticillium dahliae Kleb,Phoma uvicola Berk,Bipolaris sorokiniana(Sacc.)hoemaker,Fusarium moniliforme Sheld)都具有抑菌活性。該項(xiàng)研究為木霉在植物病害生物防治及多菌靈污染土壤修復(fù)方面的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

        關(guān)鍵詞:多菌靈;生物降解;木霉(Trichoderma sp.);降解特性;生物防治

        中圖分類號(hào):X172 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2012)07-1348-04

        Isolation, Identification of A Carbendazim-degrading Trichoderma sp. Strain and Its Characteritics in Degrading Carbendazim and Inhibiting Plant Pathogens

        ZHENG En-ze

        (Shandong Experimental High School,Jinan 250001,China)

        Abstract: A Trichoderma isolate Tr1 was isolated and identified from a vineyard soil in which carbendazim had been applied for many years. When the strain Tr1 was inoculated in minimal salts medium(MSM) with carbendazim as the sole carbon and nitrogen, the degradation rate was 45.74%. The carbendzim degradation ability could be improved by adding nitrogen, especially when 0.1% yeast powder was added, the degradation rate was about 66.57%. And the optimal degradation temperature and initial pH was 28 ℃ and 6.5, respectively. Trl could inhibit pathogenic fungi (Rhizoctonia solani,Phytophthora capsici,Verticillium dahliae Kleb,Phoma uvicola Berk,Bipolaris sorokiniana(Sacc.)hoemaker,Fusarium moniliforme Sheld) besides degrading carbendazim. Therefore, it provides the base for the application of Trichoderma Tr1 in biological control and soil remediation.

        Key words: carbendazim; biodegradition; Trichoderma; degrading charactertics; biocontrol

        多菌靈(Carbendazim,MBC)化學(xué)名稱為N-(2-苯并咪唑基)氨基甲酸甲酯,是一種廣譜高效低毒的內(nèi)吸性殺菌劑,對(duì)各種農(nóng)作物、瓜果蔬菜病害具有良好的防治效果[1]。但多菌靈本身化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,在環(huán)境中的降解半衰期較長(zhǎng)(3~6個(gè)月),可以在蔬菜、果品和土壤中殘留與累積,通過(guò)食物鏈對(duì)人畜健康造成危害,同時(shí)導(dǎo)致染色體畸形而影響后代繁衍[2]。因此,多菌靈在環(huán)境中的降解研究愈來(lái)愈受到人們的關(guān)注。

        生物降解是去除環(huán)境中多菌靈殘留的主要途徑。Pattanasupong等[3]分離得到的微生物聚生體在36 h后可完全降解100 mg/L的多菌靈。許敬亮等[4]分離到一株紅球菌(Rhodococcus sp.)在以0.01%多菌靈為惟一碳源時(shí),降解速率平均可達(dá)77.78 mg/(L·d)。田連生等[5]分離篩選到能高效降解多菌靈的木霉真菌T8-2,該菌株能夠以多菌靈為惟一碳源,在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中對(duì)100 mg/L多菌靈降解率為61.4%。本研究從受多菌靈污染的土壤中分離篩選到一株木霉(Trichoderma sp.)Tr1可降解多菌靈,同時(shí)對(duì)多種病原真菌具有抑制作用。本試驗(yàn)對(duì)木霉Tr1降解多菌靈能力和防治植物病原菌的能力進(jìn)行了研究,為其在多菌靈殘留污染土壤中的生物修復(fù)及生防中的應(yīng)用提供依據(jù)和試驗(yàn)材料。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 供試土壤和藥劑 供試土壤采自臨沂蒼山縣某長(zhǎng)期施用多菌靈的番茄種植大棚土層(10~30 cm)。50%多菌靈可濕性粉劑購(gòu)自西安美邦藥業(yè)公司,利用70%乙醇配制,濃度為100 mg/mL。

        1.1.2 培養(yǎng)基 無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基:NaCl 1.0 g,K2HPO4 1.5 g,KH2PO4 0.5 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,蒸餾水1 000 mL,多菌靈(100 mg/mL)10 mL。

        固體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基:在上述培養(yǎng)基中添加瓊脂10 g。

        PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯 200 g,葡萄糖 20 g,瓊脂 10 g,水 1 000 mL。

        1.2 方法

        1.2.1 菌株的分離、純化及鑒定 稱取土樣10 g,加到100 mL多菌靈濃度為1 000 μg/mL的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,28 ℃ 150 r/min搖床培養(yǎng)7 d,吸取10 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接到相同培養(yǎng)基中,培養(yǎng)7 d,共連續(xù)轉(zhuǎn)接5次,然后?。玻埃?μL培養(yǎng)菌液均勻涂布于含多菌靈相同濃度的固體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(含氯霉素100 μg/mL)中,28 ℃培養(yǎng)至平板上出現(xiàn)真菌菌落,將菌株轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫培養(yǎng),反復(fù)純化至純培養(yǎng)后,轉(zhuǎn)接到分離純化培養(yǎng)基中繼續(xù)搖床培養(yǎng),利用HPLC檢測(cè)多菌靈降解產(chǎn)物。根據(jù)菌絲和菌落的形態(tài)特征對(duì)菌株進(jìn)行鑒定[6]。

        1.2.2 多菌靈降解試驗(yàn) 將木霉Tr1接種到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d,用接種環(huán)挑取菌株的孢子于裝有玻璃珠和50 mL無(wú)菌水的三角瓶中,28 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)30 min,打散其孢子,采用血球計(jì)數(shù)板對(duì)孢子懸浮液計(jì)數(shù),控制分生孢子濃度為108 CFU/mL。按照無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的5%接種量接入孢子懸浮液,28 ℃搖床培養(yǎng)14 d,以不接菌的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基為對(duì)照。培養(yǎng)完畢,按照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行多菌靈降解的檢測(cè)。

        1.2.3 不同因素對(duì)菌株Tr1降解多菌靈能力的影響 在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別添加0.1%的蛋白胨、尿素、酵母抽提物、NH4NO3,按照1.2.2方法進(jìn)行搖床培養(yǎng),計(jì)算不同氮源對(duì)菌株Tr1降解多菌靈降解能力的影響。

        以28 ℃為培養(yǎng)溫度,初始pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,按照1.2.2的方法進(jìn)行搖床培養(yǎng),測(cè)定不同初始pH下多菌靈的殘留量,最后計(jì)算pH對(duì)多菌靈降解的影響。

        在添加0.1% NH4NO3為氮源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中,分別選20、25、28、30、35 ℃為處理溫度,按照1.2.2的方法進(jìn)行搖床培養(yǎng),測(cè)定不同溫度下多菌靈的殘留量,計(jì)算對(duì)多菌靈降解的影響。

        上述試驗(yàn)每處理重復(fù)3次。

        1.2.4 多菌靈降解過(guò)程中代謝產(chǎn)物的測(cè)定 制備木霉Tr1的孢子懸浮液,按照無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基(含0.1%NH4NO3)的5%接種量接入孢子懸浮液,28 ℃培養(yǎng)7 d,進(jìn)行樣品處理。采用乙酸乙酯對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行抽提,連續(xù)抽提3次,乙酸乙酯溶液中加入適量的無(wú)水硫酸鈉進(jìn)行脫水處理,然后進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā),最后利用無(wú)水甲醇溶解,送到山東省科學(xué)院測(cè)試中心進(jìn)行GC/MS檢測(cè)。

        1.2.5 木霉Tr1的抑菌活性檢測(cè) 采用平板對(duì)峙法檢測(cè)木霉Tr1的抑菌活性。各種病原菌和木霉Tr1在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后,用滅菌打孔器取帶菌絲的圓盤形培養(yǎng)基塊,將圓盤形分別帶有以下病原菌[Rhizoctonia solani,Phytophthora capsici,Verticillium dahliae Kleb, Phoma uvicola Berk, Bipolaris sorokiniana(Sacc.)Hoemaker,Fusarium moniliforme Sheld.]之一的培養(yǎng)基塊放在距PDA平板中央1.5 cm處,將木霉Tr1的培養(yǎng)基菌塊放在距病原菌菌塊3.0 cm處,28 ℃下培養(yǎng)3 d后記錄抑菌帶的寬度。計(jì)算木霉Tr1的抑菌率。

        抑菌率=(對(duì)照病原真菌生長(zhǎng)半徑-病原真菌生長(zhǎng)半徑)/對(duì)照病原真菌生長(zhǎng)半徑×100%

        2 結(jié)果與分析

        2.1 菌株的分離、篩選及鑒定

        將無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上出現(xiàn)的真菌菌落轉(zhuǎn)接到PDA平板上,經(jīng)反復(fù)純化培養(yǎng)后,轉(zhuǎn)接到以多菌靈為惟一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)14 d后,利用HPLC檢測(cè)多菌靈降解能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)1株對(duì)多菌靈的降解率達(dá)到45.47%的菌株Tr1(圖1)。

        分離得到的多菌靈降解真菌在PDA平板上菌落初期菌絲呈白色致密叢束狀,邊緣松散,呈發(fā)散狀生長(zhǎng),后期出現(xiàn)菌絲產(chǎn)孢區(qū),顏色從淺綠漸至深綠色,背面初期無(wú)色,產(chǎn)生色素。分生孢子梗從菌絲側(cè)枝生出,呈十字輪生排列,基部有小的節(jié)間,通常排列緊密,瓶梗中間部分較寬,頂生分生孢子,分生孢子光滑,亞球形至卵形(圖2)。通過(guò)一系列培養(yǎng)性狀及光學(xué)顯微鏡觀察,鑒定該菌隸屬于木霉菌屬(Trichoderma sp.),具體的種的鑒定需要通過(guò)分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)一步驗(yàn)證。

        2.2 不同因素對(duì)菌株Tr1降解多菌靈能力的影響

        在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中分別添加0.1%的蛋白胨、牛肉浸膏、尿素、酵母抽提物、NH4NO3作為氮源,14 d后取樣,檢測(cè)菌株對(duì)多菌靈的降解率,發(fā)現(xiàn)隨著不同氮源的加入,木霉Tr1對(duì)多菌靈的降解率均有所提高,尤其是加入0.1%酵母抽提物,降解率達(dá)到了66.57%,比未加氮源時(shí)有顯著的提高(圖3A)。從結(jié)果對(duì)比來(lái)看,有機(jī)氮促降解作用明顯優(yōu)于無(wú)機(jī)氮源,但為了排除有機(jī)物質(zhì)對(duì)HPLC檢測(cè)結(jié)果的影響,在后續(xù)研究中均選用0.1% NH4NO3作為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中的惟一氮源。

        初始pH對(duì)多菌靈降解的影響見(jiàn)圖3B,菌株Tr1對(duì)多菌靈降解的適宜初始pH為6~7,在此范圍內(nèi)降解率差別不明顯,而在過(guò)酸或過(guò)堿情況下均不利于菌株對(duì)多菌靈的降解。

        溫度對(duì)菌株Tr1降解多菌靈的影響見(jiàn)圖3C,可以看出,在不同溫度條件下培養(yǎng),菌株Tr1均對(duì)多菌靈有降解作用。尤其是在28 ℃搖床培養(yǎng),降解率達(dá)到了62.36%。溫度對(duì)菌體的生長(zhǎng)和酶促反應(yīng)速率影響較大,溫度升高有利于微生物進(jìn)行降解反應(yīng),但酶本身容易受溫度影響,因此,培養(yǎng)溫度高于30 ℃時(shí),降解率開(kāi)始下降。

        2.3 多菌靈降解過(guò)程中代謝產(chǎn)物

        以多菌靈為惟一碳源,采用GC/MS方法檢測(cè)多菌靈的代謝中間產(chǎn)物。結(jié)果在木霉Tr1培養(yǎng)7 d時(shí),發(fā)現(xiàn)一種代謝產(chǎn)物:2-氨基苯并咪唑(2-AB)。通過(guò)生物培養(yǎng)表明,該菌能夠以2-氨基苯并咪唑?yàn)槲┮惶荚瓷L(zhǎng),這為多菌靈降解提供了條件。

        2.4 木霉Tr1的抑菌活性

        以各種病原菌為拮抗對(duì)象,檢測(cè)木霉Tr1的抑菌活性,發(fā)現(xiàn)該木霉對(duì)各種病原菌均具有一定的抑菌活性,尤其是對(duì)紋枯病菌(Rhizoctonia solani)的抑菌率達(dá)到了79.49%,對(duì)辣椒疫病病原(Phytophthora capsici)的抑菌率為74.51%(圖4)。說(shuō)明本研究中篩選到的木霉既能降解多菌靈,也能抑制各種病原真菌,為今后木霉在生防及土壤修復(fù)方面的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

        3 結(jié)論與討論

        多菌靈作為一種廣譜內(nèi)吸性殺菌劑,對(duì)各種病原真菌尤其是子囊菌和半知菌引起的病害具有較好的防治效果,但該殺菌劑在環(huán)境中的殘效期較長(zhǎng),可以在蔬菜、果品和土壤中殘留與累積,通過(guò)食物鏈對(duì)人畜健康造成危害[8],因此,利用微生物降解多菌靈是非常有效的方法。本研究從長(zhǎng)期受多菌靈污染的土壤中分離到一株能夠降解多菌靈的菌株,通過(guò)一系列培養(yǎng)性狀及光學(xué)顯微鏡觀察鑒定為木霉菌(Trichoderma sp.)。

        研究了各種因素對(duì)木霉Tr1降解多菌靈能力的影響。在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加氮源,有利于多菌靈的降解,尤其是有機(jī)氮源作為惟一氮源生長(zhǎng)時(shí)要優(yōu)于硝酸銨無(wú)機(jī)氮源。該菌株的最適生長(zhǎng)溫度為28 ℃,最適初始pH為6.5。

        采用GC/MS方法初步檢測(cè)了多菌靈降解過(guò)程中的代謝產(chǎn)物,發(fā)現(xiàn)木霉Tr1在無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)7 d后,代謝產(chǎn)物主要是2-氨基苯并咪唑(2-AB)。Xu等[9]報(bào)道Rhodococcus qingshengii菌株djl-6降解多菌靈過(guò)程中產(chǎn)生的代謝中間產(chǎn)物是2-AB和苯并咪唑(BI),黃玉杰等[7]報(bào)道紅平紅球菌djl-11降解多菌靈的代謝中間產(chǎn)物是2-AB和2-羥基苯并咪唑(2-HB)。而本研究中未發(fā)現(xiàn)BI和2-HB,推測(cè)上述報(bào)道中降解多菌靈的菌株主要是細(xì)菌類,該研究中篩選到的多菌靈降解木霉Tr1為真菌類,降解機(jī)制存在差異性。根據(jù)上述報(bào)道及本研究可以推斷2-氨基苯并咪唑(2-AB)是多菌靈降解過(guò)程中的主要代謝中間產(chǎn)物。

        該研究中分離到的木霉Tr1除了能降解多菌靈,對(duì)各種病原真菌也具有一定的抑菌活性。尤其是對(duì)引起小麥紋枯病的Rhizoctonia solani抑菌率達(dá)到了79.49%。說(shuō)明本研究中篩選到的木霉既能降解多菌靈,也能抑制各種病原真菌,為今后木霉在生防及土壤修復(fù)方面的應(yīng)用提供了依據(jù)。

        致謝:本研究主要是依托山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成的。期間得到了山東省實(shí)驗(yàn)中學(xué)石磊老師、山東省科學(xué)院中日友好生物技術(shù)研究中心張新建老師的指導(dǎo),特此致謝。

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