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        堿性磷酸酶(AKP)的特性分析研究

        2012-12-31 00:00:00薛軍儒
        2012年13期

        摘要:堿性磷酸酶(AKP)是在堿性條件下水解多種磷酸酯并具有轉(zhuǎn)磷酸基作用的一組酶,并且在較高溫度下仍具有活性。本實(shí)驗(yàn)由含pET21a-AKP表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌制備堿性磷酸酶,通過一系列分離純化的實(shí)驗(yàn)提純了堿性磷酸酶。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)純化之后的AKP進(jìn)行酶促反應(yīng)速率曲線的測(cè)定、測(cè)定激活劑和抑制劑對(duì)AKP活性的影響、測(cè)定抑制劑對(duì)酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響、測(cè)定AKP的最適溫度和pH以及AKP的變性和復(fù)性等實(shí)驗(yàn)來研究AKP的特性。

        關(guān)鍵詞:堿性磷酸酶(AKP); 反應(yīng)速率曲線;激活劑;抑制劑;變性;復(fù)性;酶活力大腸桿菌堿性磷酸酶( EC. 3. 1. 3. 1), 是同二聚體金屬酶,能催化非特異性磷酸單酯水解,分子量是56 Kda。它的兩個(gè)單體結(jié)合成具有兩個(gè)活性中心的對(duì)稱的活性酶,每個(gè)活性中心包含3 個(gè)金屬原子,即兩個(gè)鋅原子和一個(gè)鎂原子。大腸桿菌堿性磷酸酶被phoA 基因編碼,和其他分泌蛋白質(zhì)一樣,以在氨基末端帶有一個(gè)信號(hào)肽的前體合成,轉(zhuǎn)錄后穿過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),信號(hào)肽被除去,兩個(gè)成熟的單體二聚化。

        堿性磷酸酶即AKP來源廣泛,可來源于細(xì)菌、真菌、藻類、無脊椎動(dòng)物及脊椎動(dòng)物。AKP廣泛存在于各種生物體內(nèi),參與細(xì)胞磷代謝和信號(hào)肽轉(zhuǎn)導(dǎo)的一種磷酸酶。

        AKP能催化除去DNA、RNA、三磷酸核糖核苷和三磷酸脫氧核糖核苷的5’磷酸基團(tuán);去除線狀DNA兩端的5’磷酸可以最大限度地減少質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化;蛋白質(zhì)的去磷酸化。大腸桿菌堿性磷酸酶是一種有用的工具酶,在免疫學(xué)研究中常用作酶聯(lián)試劑,將AKP與顯色劑或去磷酸化后能發(fā)光的底物相互作用來揭示靶與檢測(cè)酶復(fù)合物的存在。AKP作為一種工具酶在表位連鎖圖譜、組織化學(xué)、免疫印跡、突變分析等方面有廣泛應(yīng)用,在臨床上作為同工酶,疾病診斷,研究磷的代謝等。

        本實(shí)驗(yàn)對(duì)堿性磷酸酶的特性研究主要是通過對(duì)酶活力的測(cè)定來分析的。酶活性也

        稱為酶活力,按照國際酶學(xué)委員會(huì)的規(guī)定,1個(gè)酶活力國際單位是指在最適反應(yīng)條件(指最適pH、溫度25℃等)下,1分鐘內(nèi)能催化1微摩爾底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。酶活力的大小可以用在一定條件下所催化的化學(xué)反應(yīng)的速率來表示,反應(yīng)速率愈快,就表明酶活力愈高。酶催化的反應(yīng)速率可用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示,實(shí)際酶活測(cè)定中一般以測(cè)定產(chǎn)物的增加量為準(zhǔn)。AKP活力的測(cè)定是以pNPP為底物,采用分光光度計(jì)法來測(cè)定AKP的活力的。

        一、材料與方法

        1.酶促反應(yīng)的速率曲線的測(cè)定:

        1.1材料:由AKP分離純化實(shí)驗(yàn)中制備的AKP溶液

        1.2試劑:測(cè)活液(50mmol/L Tris-HCl pH 8.5,0.2mg/mL BSA,10mmol/L pNPP,2mmol/L MgAc2,pH= 8.5)、酶稀釋液(50mmol/L Tris-HCl,0.2mg/mL BSA,pH=8.5)、終止液(0.5mol/L Na3PO4,10mmol/L EDTA)

        1.3儀器:試管;試劑瓶;藥匙;移液槍;玻棒;水浴鍋;分光光度計(jì);比色杯;燒杯;分析天平;小指管;

        1.4實(shí)驗(yàn)方法:

        1.4.1確定AKP的最佳稀釋倍數(shù)。將酶分別稀釋不同倍數(shù),在30℃水浴鍋中與測(cè)活液反應(yīng)10min,測(cè)溶液在410nm處的吸收峰,取吸光度值為0.7—0.9之間的稀釋倍數(shù)。

        1.4.2 AKP特性分析一-酶促反應(yīng)的速率曲線測(cè)定。用已測(cè)的倍數(shù)稀釋酶,與測(cè)活液在30°C分別反應(yīng)0,3,6,9,12,15,18,21,24,30分鐘,測(cè)溶液在410nm處的吸收值。每個(gè)反應(yīng)測(cè)兩次,求平均值。以吸光度A410為縱坐標(biāo),時(shí)間為橫坐標(biāo)繪制時(shí)間作用曲線。

        2.pH對(duì)AKP的酶活性的影響:

        2.1材料:由AKP分離純化實(shí)驗(yàn)中制備的AKP溶液

        2.2試劑:測(cè)活液(50 mmol/ L Tris-HCl,pH=7.5,8.5,9.5;50mmol/ L Caps-NaOH,pH=9.5,10.5,11.5)

        2.3儀器:試管;試劑瓶;藥匙;移液槍;玻棒;水浴鍋;分光光度計(jì);比色杯;燒杯;分析天平;小指管;

        2.4實(shí)驗(yàn)方法:30℃條件下,分別在pH為7.5、8.5、9.5的50 mmol/ L Tris-HCl (含2 mmol/ LMgCl2)緩沖液配制的測(cè)活液及pH為9.5、10.5、11.5的50 mmol/ L Caps-NaOH (含2 mmol/ L MgCl2)緩沖液配制的測(cè)活液,反應(yīng)10min后,在410nm波長(zhǎng)下測(cè)定AKP催化pNPP水解的吸光度值。

        3.溫度對(duì)AKP的酶活性的影響:

        3.1材料:由AKP分離純化實(shí)驗(yàn)中制備的AKP溶液

        3.2試劑:測(cè)活液(50 mmol/ L Tris-HCl,pH=7.5,8.5,9.5;50mmol/ L Caps-NaOH,pH=9.5,10.5,11.5)

        3.3儀器:試管;試劑瓶;藥匙;移液槍;玻棒;水浴鍋;電磁爐;分光光度計(jì);比色杯;燒杯;分析天平;小指管;

        3.4實(shí)驗(yàn)方法:測(cè)活液在50mmol/L Tris-HCl (含2mmol/ LMgCl2)緩沖中液配制而成,pH=8.5,分別在溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃和100℃條件下反應(yīng)10min,在410nm波長(zhǎng)下測(cè)定AKP催化pNPP水解的吸光度值。

        二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        1.AKP的時(shí)間作用曲線:

        表1 測(cè)活液ul360稀釋液ul40AKP ul4030℃反應(yīng)時(shí)間 min時(shí)間梯度 終止液ml3.6A 410(1) A 410(2)平均值時(shí)間設(shè)定為0、3、6、9、12、15、18、21、24min, A 410 的平均值是0、0.058、0.227、0.356、0.473、0.632、0.636、0.659、0.708、0.932。2.不同溫度對(duì)AKP的酶活性的影響:

        表2測(cè)活液ul360稀釋液ul40AKP ul40反應(yīng)時(shí)間min10 終止液ml3.6A 410(1) A 410(2)平均值反應(yīng)溫度設(shè)定梯度:30、40、50、60、70、80、90、100℃。A 410 的平均值是0.152、0.34、0.409、0.5515、0.576、0.799、0.44、0.103。

        3.不同pH對(duì)AKP的酶活性的影響:

        表3測(cè)活液ul360稀釋液ul40AKP ul40反應(yīng)時(shí)間min10 終止液ml3.6A 410(1) A 410(2)平均值pH設(shè)定梯度:7.5、8.5、9.5、9.5、10.5、11.5。A 410 的平均值是0.3395、0.375、0.4645、0.367、0.3035、0.603。

        三、討論

        酶催化的反應(yīng)速率通常用單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的增加量來表示。隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)行,產(chǎn)物的變化量也在發(fā)生改變。因此特定條件下,酶促反應(yīng)速率只在一定的時(shí)間范圍內(nèi)保持恒定,也只有此時(shí)的反應(yīng)速率(初速率,v0)才能真正體現(xiàn)酶的活力。在具體的實(shí)驗(yàn)中,可以通過酶促反應(yīng)的時(shí)間作用曲線來尋找v0,以便確定酶促反應(yīng)的特定條件。由圖可知,酶促反應(yīng)的速率(即圖象的斜率)是隨著反應(yīng)時(shí)間的增大而減小的,與預(yù)期結(jié)果相符。

        就理論而言,酶是蛋白質(zhì),具有許多可解離的極性基團(tuán),在不同的酸堿環(huán)境中,這些基團(tuán)的解離狀態(tài)不同,所帶電荷不同,而它的解離狀態(tài)對(duì)保持酶的結(jié)構(gòu),底物與酶的結(jié)合能力以及催化能力都有重要作用,因此溶液的pH對(duì)酶活性影響很大。若其他條件不變,酶只有在一定的pH范圍內(nèi)才能表現(xiàn)催化活性且在某一pH時(shí),酶的催化活力最大,此pH稱為酶的最適pH。正常情況下,所測(cè)得的酶活性隨pH值的變化情況為一鐘罩形曲線,曲線的頂點(diǎn)即為該酶的最適pH值。有研究表明,大腸桿菌堿性磷酸酶的最適pH值為9.5~10.5。顯然我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不理想。本來可以看出最適pH為9.5,但是后來在pH為11.5時(shí),酶的活力又增強(qiáng)了分析原因?yàn)閴A性磷酸酶本身出現(xiàn)了問題,或者是被污染,或者是產(chǎn)生了變異。

        化學(xué)反應(yīng)速度一般隨溫度的升高而加快,但在酶促反應(yīng)中,隨著溫度的升高,蛋白質(zhì)的變性速度也在加快,因此在酶催化的反應(yīng)中,升高溫度既可以使反應(yīng)速度加快,同時(shí)又會(huì)引起酶的失活而降低反應(yīng)速度,只有在某一溫度時(shí),酶促反應(yīng)的速度最大,此時(shí)的溫度稱為酶作用的最適溫度。需要注意,體外實(shí)驗(yàn)時(shí),酶作用的最適溫度不是一個(gè)恒定不變的常數(shù),而與反應(yīng)時(shí)間有關(guān),這說明酶的最適溫度只是在一定條件下才有意義。(作者單位:菏澤學(xué)院)

        參考文獻(xiàn):

        [1]《高級(jí)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)講義》,生命科學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心。

        [2]《分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》,魏群主編,高等教育出版社

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