張 杰，李運(yùn)生

（河南工程學(xué)院，河南 鄭州 451191）

活性氧損傷對園林植物幼苗葉綠素的降解效應(yīng)

張 杰，李運(yùn)生

（河南工程學(xué)院，河南 鄭州 451191）

以抗旱性較弱的河南海棠和抗旱性較強(qiáng)的山荊子的種子為試驗(yàn)材料，用20%聚乙二醇（PEG-6000）溶液模擬水分脅迫處理，探討了水分脅迫下活性氧損傷對蘋果幼苗葉綠素降解的效應(yīng)。結(jié)果顯示：（1）在水分脅迫下，·、H2O2、MDA、PMP含量均隨著處理時(shí)間的延長，呈現(xiàn)不同程度的提高。（2）水分脅迫下，對H2O2、MDA、PMP的響應(yīng)幅度為，河南海棠＞山荊子。（3）、H2O2、MDA、PMP與葉綠素含量間均呈顯著負(fù)相關(guān)。（4）水分脅迫下, 兩種試材幼苗葉綠素含量降低，與活性氧損傷密切相關(guān)。

園林植物；水分脅迫；活性氧；葉綠素降解

水分脅迫是影響全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要因素之一，它也是植物在逆境條件下所發(fā)生的最為普遍的形式[1]。在發(fā)生水分脅迫的環(huán)境下，植物會(huì)隨之發(fā)生相應(yīng)的生理和形態(tài)變化，導(dǎo)致植物體內(nèi)的細(xì)胞失水以及代謝失調(diào)，進(jìn)而加速其衰老進(jìn)程。在植物體衰老進(jìn)程中，最明顯的特征是葉綠素逐步降解[2]。相關(guān)研究顯示，在水分脅迫、低溫、高溫、SO2以及衰老的進(jìn)程中，葉綠素的降解與活性氧代謝有關(guān)[3]。水分脅迫條件下，由于葉綠素的降解可導(dǎo)致蘋果屬植物的衰老，但這種衰老是否也與活性氧的氧化有有關(guān)，尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以抗旱性較弱的河南海棠和抗旱性較強(qiáng)的山荊子的營養(yǎng)液水培苗為試材，進(jìn)行PEG模擬干旱實(shí)驗(yàn)，探討水分脅迫誘導(dǎo)蘋果屬植物衰老的生理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材 料

選取河南海棠Malus honanensis（抗旱性較弱）和山荊子Malus baccata（抗旱性較強(qiáng)）的種子，采后經(jīng)篩選和消毒后4 ℃層積處理。精選長勢一致的幼苗于溫室內(nèi)培養(yǎng)[4]。當(dāng)幼苗出現(xiàn)4片真葉時(shí)至于1/2Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)一周，然后用Hoagland全營養(yǎng)液培養(yǎng)。試驗(yàn)期間營養(yǎng)液pH調(diào)至6.0，每周更換一次；溫室溫度白天23～28℃，夜間 18 ～ 22℃；照度 400 μmol·m-2s-1，每天恒定光照約14 h。

1.2 供試處理

實(shí)驗(yàn)采用20%聚乙二醇（PEG-6000，上海化學(xué)試劑一廠）溶液模擬水分脅迫處理。70 d齡幼苗移入20%PEG6000的營養(yǎng)液中脅迫處理，對照（CK）用不含20%PEG6000的Hoagland全營養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 外源活性氧清除劑和促進(jìn)·OH形成的預(yù)處理

在脅迫處理前1d分別用配置的下述溶液對河南海棠和山荊子 幼苗進(jìn)行浸根處理，對照（CK）為dd H2O。溶液：10 mmol/L Vit E，10 mmol/L ASA，10 mmol/L甘 露 醇，10 mmol/L H2O2，10 mmol/L FeSO4，10 mmol/L H2O2+10 mmol/L FeSO4。

1.4 測定方法

取樣每隔2d進(jìn)行1次，早晨8:00取樣，葉片取自幼苗頂端第3～5片葉[5-6]；每次測定重復(fù)5次。

（1）葉綠素含量(Chl)的測定按文獻(xiàn)[7]的方法進(jìn)行。(2) O2-·含量的測定按文獻(xiàn)[8]的方法進(jìn)行。（3）H2O2含量的測定參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行。（4）MDA含量測定按文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行。（5）PMP的測定按文獻(xiàn)[11]的方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分脅迫對河南海棠和山荊子幼苗葉片葉綠素含量（Chl）的影響

如圖1所示，不含20%PEG6000的Hoagland全營養(yǎng)液培養(yǎng)的兩種試材的對照Chl含量變化幅度較為平穩(wěn)。經(jīng)過20%PEG6000的Hoagland營養(yǎng)液培養(yǎng)的兩種試材的Chl含量呈現(xiàn)不同的變化。河南海棠在脅迫處理前3d, Chl含量變化平穩(wěn)，在地5 d時(shí)下降幅度較大，比CK降低12.1%，到第11d時(shí)，下降幅度更大，比CK降低67.2%。而山荊子 Chl含量下降幅度較為緩慢，在脅迫的第5d和第11d分別比CK降低了7.9%和52.8%。

2.2 水分脅迫下對河南海棠和山荊子葉片·含量的影響

如圖2所示，在不含20%PEG6000的Hoagland全營養(yǎng)液培養(yǎng)的兩種試材的·含量差異并不十分明顯。而在20%PEG6000的Hoagland全營養(yǎng)液培養(yǎng)的兩種試材變化并不一致。逆境條件下，河南海棠的·含量隨脅迫時(shí)間的延長呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢，在處理第3d，·含量比 CK 增加了33.1%，在第11d的含量竟達(dá)到CK的1.7倍。山荊子·含量的上升幅度較為緩慢，在處理的第5 d，·含量才有一個(gè)小幅提升，比CK提高了約18.9%，在脅迫第11d的·含量是 CK 的 1.1倍。

圖1 水分脅迫對河南海棠和山荊子幼苗葉綠素含量的影響Fig.1Effects of water stress on chlorophyll contents of M. honanensis and M. baccata seedlings

圖2 水分脅迫對河南海棠和山荊子幼苗·含量的影響Fig.2Effects of water stress on · contents of M. honanensis and M. baccata seedlings

2.3 水分脅迫下河南海棠和山荊子葉片H2O2含量的變化

在不含20%PEG6000的Hoagland全營養(yǎng)液培養(yǎng)的兩種試材的H2O2含量差異并不十分明顯（圖3）。水分脅迫下，河南海棠的H2O2含量在脅迫第5 d后，呈現(xiàn)大幅上升趨勢，在脅迫的第5 d和第11d，分別比對照提高了43.9%和122.8%；山荊子 的H2O2含量到了脅迫第7 d，才有上升相對明顯。它在脅迫的第5 d和第11d，分別比對照提高了24.9%和91.2%。

圖3 水分脅迫對河南海棠和山荊子幼苗H2O2含量的影響Fig.3Effects of water stress on H2O2 contents of M. honanensis and M. baccata seedlings

2.4 水分脅迫下河南海棠和山荊子 葉片MDA含量的變化

不含20%PEG6000的Hoagland全營養(yǎng)液培養(yǎng)的兩種試材的MDA含量變化幅度不明顯（圖4）。而在20%PEG6000的Hoagland全營養(yǎng)液培養(yǎng)的兩種試材變化幅度不同。河南海棠在處理第7 d后開始大幅上升，而山荊子 到第9 d才上升明顯；在脅迫的第7 d和第11d，河南海棠和山荊子 的MDA含量分別相對于CK提高了45.1%、149.2%和26.9%、103.8%。

2.5 水分脅迫對河南海棠和山荊子葉片PMP的影響

如圖5所示，不含20%PEG6000的Hoagland全營養(yǎng)液培養(yǎng)的兩種試材的PMP含量變化不大。水分脅迫下的河南海棠，在處理的第7 d，其葉片內(nèi)PMP含量就有大幅上升，在脅迫的第7 d和第11d的PMP含量，分別比CK提高了54.9%和176.8%。山荊子 的PMP含量上升幅度不是很快，其在處理的第9 d，PMP含量才有明顯提高，在脅迫的第7 d和第11d的PMP含量，分別比CK提高了36.1%和102.0%。

圖4 水分脅迫對河南海棠和山荊子幼苗MDA含量的影響Fig.4 Effects of water stress on MDA contents of M. honanensis and M. baccata seedlings

圖5 水分脅迫對河南海棠和山荊子幼苗脂膜相對透性的影響Fig.5 Effects of water stress on relative permeability of lipid membranes in M. honanensis and M. baccata seedlings

2.6 葉綠素含量與·、H2O2、MDA、PMP 間的相關(guān)回歸分析

由上文分析得知，各測試指標(biāo)含量均隨著脅迫的加劇，呈現(xiàn)上升的趨勢。而表1顯示，在水分脅迫下，·、H2O2、MDA、PMP 的含量與 Chl含量呈顯著的負(fù)相關(guān)。這說明在水分脅迫環(huán)境下，葉綠素含量降低機(jī)制與活性氧的代謝失調(diào)所引發(fā)的自由基傷害機(jī)理有關(guān)[9]。

表1 水分脅迫下河南海棠和山荊子葉片·、H2O2、DA、PMP與葉綠素含量間的相關(guān)回歸分析Table 1Correlation and regression analysis between O2-, H2O2, MDA, PMP and chlorophyll in M. honanensis and M. baccata leaves under water stress

表1 水分脅迫下河南海棠和山荊子葉片·、H2O2、DA、PMP與葉綠素含量間的相關(guān)回歸分析Table 1Correlation and regression analysis between O2-, H2O2, MDA, PMP and chlorophyll in M. honanensis and M. baccata leaves under water stress

相關(guān)因素 河南海棠 山荊子回歸方程 相關(guān)系數(shù) 回歸方程 相關(guān)系數(shù)O2-與ChloroPhyⅡ Y=0.180 7+4.440 0x -0.809 3＊Y=-0.200 5+4.080 6x -0.818 2＊H2O2與ChloroPhyⅡ Y=0.108 0+4.689 2x -0.8726＊＊Y=-0.104 2+4.248 7x -0.838 5＊＊MDA與ChloroPhyⅡ Y=0.366 1+3.745 7x -0.814 4＊Y=-0.1535+4.084 5x -0.820 8＊PMP與ChloroPhyⅡ Y=0.076 7+4.278 7x -0.787 6＊Y=-0.1029+4.147 3x -0.757 8＊

2.7 外源活性氧清除劑Vit E、ASA及甘露醇對水分脅迫兩種試材MDA相對含量及葉綠素相對含量的影響

圖6和圖7顯示：水分脅迫下，MDA含量的增加與活性氧清除劑的抑制相關(guān)聯(lián)，與此同時(shí)對葉綠素的破壞也進(jìn)行了抑制。因而可知，水分脅迫下葉綠素的降低與活性氧的作用有關(guān)。由圖可見，MDA含量下降幅度以及葉綠素抑制程度，河南海棠＞山荊子 。

圖6 VitE、ASA和甘露醇對水分脅迫處理二天后河南海棠和山荊子幼苗MDA相對含量的影響Fig.6 Effects of VitE,ASA and mannite on MDA contents in M. honanensis and M. baccata seedlings after two day’s water stress treatment

圖7 VitE、ASA和甘露醇對水分脅迫處理二天后河南海棠和山荊子幼苗葉綠素相對含量的影響Fig.7 Effects of VitE,ASA and mannite on chlorophyll contents in M. honanensis and M. baccata seedlings after two day’s water stress treatment

2.8 Fe2+、H2O2和Fenton反應(yīng)對水分脅迫下兩種試材幼苗MDA含量和葉綠素含量的影響

文章對水分脅迫下處理的兩種試材進(jìn)行了預(yù)處理，外加了Fe2+、H2O2和Fenton反應(yīng)。表2顯示：Fe2+、H2O2都能對MDA的增加其促進(jìn)作用，F(xiàn)e2+的促進(jìn)作用更大一些。Fe2+、H2O2的協(xié)同作用可累積更多的MDA。進(jìn)而說明在水分脅迫環(huán)境下兩種試材均發(fā)生了Fenton反應(yīng)，從而引起葉綠素含量明顯降低，其中河南海棠降幅遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于山荊子 。

表2 H2O2、Fe2+和Fenton反應(yīng)對水分脅迫二天后河南海棠和山荊子幼苗MDA和葉綠素相對含量的影響Table 2Effects of H2O2, Fe2+ and Fenton reaction on chlorophyll contents and MDA in M.honanensis and M. baccata seedlings after two day’s water stress treatment

3 討 論

植物衰老的原發(fā)過程和真正標(biāo)志那就是葉綠素的分解[12]，水分脅迫環(huán)境條件下，由于氧自由基的不斷增加，導(dǎo)致植物葉片葉綠素含量降低和衰老。而相對于生長旺盛的葉片而言，由于其本身就具有保護(hù)酶系統(tǒng)，例如SOD、POD、CAT等，具有較為活躍的活躍的清除活性氧的機(jī)制，通常情況下，活性氧處于一種動(dòng)態(tài)平衡中。然而，在逆境環(huán)境條件下，這種平衡就會(huì)被打破，導(dǎo)致活性氧的累積，進(jìn)而導(dǎo)致葉片衰老、脫落和死亡[13-14]。本實(shí)驗(yàn)表明，干旱條件下，·含量隨脅迫時(shí)間的延長呈現(xiàn)出逐漸上升的趨勢。河南海棠在處理第3d，·含量就快速升高，山荊子含量的上升幅度較為緩慢，在處理的第5 d，才有一個(gè)小幅提升。兩種試材的H2O2含量的幅度上升的脅迫時(shí)間要比·出現(xiàn)的晚，河南海棠的H2O2含量在脅迫第5 d后，呈現(xiàn)大幅上升趨勢，山荊子 的H2O2含量到了脅迫第7d，才有上升相對明顯。該現(xiàn)象表明，在水分脅迫條件下，葉片內(nèi)SOD酶活性水平隨著·含量的增加而增加，而·的歧化反應(yīng)就是由于SOD酶活性水平提高所誘導(dǎo),這與前人研究結(jié)果相一致[15]。

[1] 王有年,杜 方,于同泉,等. 水分脅迫對桃葉片碳水化合物及其相關(guān)酶活性的影響[J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 2001,(4):12-15 .[2] 于同泉,秦 嶺,王有年. 滲透脅迫板栗苗可溶性糖的積累及組分變化的研究[J]. 北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 1996,(1):21-22.

[3] 韓蕊蓮,李麗霞,梁宗鎖. 干旱脅迫下沙棘葉片細(xì)胞膜透性與滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2003,(1):34-36 .

[4] 米海莉,許 興,李樹華,等. 干旱脅迫下牛心樸子幼苗相對含水量、質(zhì)膜透性及保護(hù)酶活性變化[J]. 西北植物學(xué)報(bào),2003, (11):6-8.

[6] 陶大立,何興元. 國內(nèi)植物環(huán)境脅迫研究應(yīng)注意的幾個(gè)基本問題[J]. 生態(tài)學(xué)雜志, 2009,(1):7-9.

[7] 胡曉立,李彥慧,陳東亮,等. 3種李屬彩葉植物對NaCl脅迫的生理響應(yīng)[J]. 西北植物學(xué)報(bào),2010,(2):17-18.

[8] 鄭愛珍. 鎘脅迫對芥藍(lán)根系質(zhì)膜過氧化及ATPase活性的影響[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào),2012,(2):15-17.

[9] 謝志玉,張文輝,劉新成. 干旱脅迫對文冠果幼苗生長和生理生化特征的影響[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2010,(5):21-23.

[10] 常二梅，史勝青，劉建鋒，等. 古側(cè)柏種子活力與樹齡的關(guān)系研究[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2012,(1):7-9.

[11] 李合生．植物生理生化實(shí)驗(yàn)原理和技術(shù)[M]．北京:高等教育出版社,2000.

[12] 李彩鳳，趙麗影， 陳業(yè)婷，等. 高等植物脂氧合酶研究進(jìn)展[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2010,(10):44-46.

[13] Wang R, M Kato, F Nishikawa, et al. Initiation of senescence and metabolic changes in broccoli florets by wounding of harvested broccoli stem tissue:VII．Involvement of ethylene in senescence of harvested broccoli florets[J]. J. Japan Soc. Hort.Sci.,2001,70(2):464.

[14] 萊謝姆Y. Y等著.植物衰老過程與調(diào)控[M]．沈陽：遼寧科學(xué)技術(shù)出版社,1990.

[15] Barry J Pogson, Stephen C Morris. Consequences of cool storage of broccoli on physiological and biochemical changes and subsequent Senescence at 20℃[J]. J. Amer. Soc. Hoft, Sci.,1997, 122(4):553-558.

[16] Irving D e, Baird V M. Heat production and respiration by broccoli fl orets during senescence at 20℃[J]. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science, 1996,24:199-202.

[17] 侯向陽. 硅對干旱脅迫下草坪草生長及抗旱性影響的研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[18] 陳少瑜,郎南軍,賈利強(qiáng)，等.干旱脅迫對坡柳等抗旱樹種幼苗膜脂過氧化及保護(hù)酶活性的影響[J].植物研究,2006,26(1):17-18．

[19] Takeuchi Y, Kubo H, Kasahara H, et a1．Adaptive alteratiosns in the actives of scavengers of active oxygen in cucumber cotyledons irradiated with UV-B[J]. Physiol,1996,147:589-592．

[20] Bowler C,Van Montagu M,Inze D．Superoxide dismutase and stress tolerance．Annual Review of Plant[J]．Physiology and Plant Molecular Biology,1992,43:83-116．

[21] Nicholas S S,Quinton J C．Hydroxyl radicalscav enging activity of compatible solutes[J]．Phytochemistry,1989,28:1057-1060．

[22] Zhao F Y Guo S L,Wang Z L, et a1．Recent advances in study on transgenic plants for salt tolerance[J]．Journal of Plant Physiology and Molecular Biology,2003,29:171-178．

Degradation effects of active oxygen damage on garden plant seedling chlorophyll

ZHANG Jie, LI Yun-sheng
(Henan Institute of Engineering, Zhengzhou 451191, Henan, China)

With the weak drought resistance Malus honanensis and strong drought resistance Malus baccata seeds as the test materials, using 20% polyethylene glycol ( PEG-6000) solution to simulate water stress treatment, the degradation effects of active oxygen damage active oxygen damage on garden plant seedling chlorophyll have been studied. The results show that (1) under water stress, O2-·, H2O2, MDA, PMP content increased in varying degrees as the duration of treatment prolonged; (2) under water stress, the response amplitude of Henan begonia to O2-·, H2O2, MDA, PMP were larger than Malus baccata; (3) there were signif i cant negative correlation between O2-·, H2O2, MDA, PMP and chlorophyll contents; (4) under water stress, the decrease of two kinds of test materials chlorophyll content was closely related to the active oxygen damage.

landscape plants; water stress; reactive oxygen; chlorophyll degradation

S718.43

A

1673-923X(2012)09-0073-05

2012-07-10

河南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目(12B220001)；河南省教育廳項(xiàng)目(2011B220001)

張 杰（1975-），男，講師，研究方向?yàn)閳@林教學(xué)與科研；E-mail:zhangjie8785@163.com

[本文編校：吳 毅]