劉 果，謝耀堅，張黨權(quán) ，谷振軍

（1.國家林業(yè)局桉樹研究開發(fā)中心，廣東 湛江 524022；2.中南林業(yè)科技大學(xué)；a.林業(yè)生物技術(shù)湖南省重點實驗室；b.經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室；c.經(jīng)濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004）

基于基因組DNA混合池的EST-SSR引物快速篩選方法研究

劉 果1，謝耀堅1，張黨權(quán)2，谷振軍2

（1.國家林業(yè)局桉樹研究開發(fā)中心，廣東 湛江 524022；2.中南林業(yè)科技大學(xué)；a.林業(yè)生物技術(shù)湖南省重點實驗室；b.經(jīng)濟林育種與栽培國家林業(yè)局重點實驗室；c.經(jīng)濟林培育與保護省部共建教育部重點實驗室，湖南 長沙 410004）

林木SSR標記的引物篩選工作量大，十分費時且消耗大量實驗材料。采用基因組DNA混合池技術(shù)，將研究對象的若干個基因組DNA樣品等量混合后，作為單一模板進行SSR的PCR擴增，能顯著降低實驗的工作量和成本。以選擇的150對EST-SSR引物為對象，對6個桉樹基因組DNA樣品進行等量混合，進行PCR擴增篩選引物，結(jié)果表明，與常規(guī)篩選方法相比，基因組DNA混合池方法大幅度縮短了實驗周期，顯著減少了基因組DNA的消耗，可用于大量林木SSR引物的快速高效篩選。

基因組DNA混合池；引物篩選；EST-SSR，PCR

簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeats, SSR)又稱微衛(wèi)星序列，廣泛分布于整個基因組。SSR作為DNA遺傳標記具有高度變異性、共顯性、重復(fù)性好、基因組覆蓋率高等優(yōu)異特性而被廣泛應(yīng)用[1-4]。近些年，利用大量公共ESTs數(shù)據(jù)庫來開發(fā)EST-SSR標記已成為一種非常有效的途徑。與傳統(tǒng)SSR標記開發(fā)相比，基于數(shù)據(jù)庫的EST-SSR標記開發(fā)無需構(gòu)建基因組文庫或EST文庫，也無需再進行克隆測序，而且還充分利用了現(xiàn)有的數(shù)據(jù)資源，極大地降低了開發(fā)成本。EST-SSR來自于基因組的轉(zhuǎn)錄區(qū)域，因此表現(xiàn)的更為保守為，在其他相近物種中通用性更好[5-7]，且與很多重要的功能位點連鎖不平衡[8]。在大多數(shù)群體的遺傳分析中表明，EST-SSR標記能很好的揭示高水平的遺傳變異[7-11]。EST-SSR標記在構(gòu)建遺傳圖譜、群體遺傳多樣性、進化遺傳學(xué)已經(jīng)種質(zhì)資源收集等方面有很大的研究潛力。

桉樹是世界上著名的經(jīng)營利用樹種之一，由于其生長速度快、輪伐期短、耐干旱、耐瘦瘠、適應(yīng)性廣，且用途廣泛，經(jīng)濟效益高，現(xiàn)已被世界近百個國家與地區(qū)引種，遍布于中南海地區(qū)、東南亞、美洲和非洲，目前已經(jīng)成為世界人工林的第二大類造林樹種[12-13]。在桉屬植物中SSR標記有高度的保守性和遺傳多樣性，所以對桉樹進行SSR標記分析，非常有利于對桉樹遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性與分子標記輔助選擇育種研究[14]。截至2012年5月，在公共數(shù)據(jù)庫NCBI中已有16萬多條桉樹的EST序列，采用傳統(tǒng)篩選方法進行大量SSR引物開發(fā)耗時費力。近年來在國際上逐漸被廣泛應(yīng)用的DNA混合池技術(shù)[15]能有效解決這個問題，可以最大限度的減少研究人員的工作量和試劑成本，使得大量引物的開發(fā)工作成為可能。DNA混合池技術(shù)是把多個樣本的DNA溶液混合在一起進行PCR擴增、基因掃描、基因分型、最后用統(tǒng)計學(xué)方法對數(shù)據(jù)進行分析[16]。對組成混合池的樣本數(shù)量沒有固定的要求，少到幾個、多到幾千個樣本都可以組成DNA混合池[17-18]。 DNA混合池技術(shù)近年來在國際上已被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)上各種疾病的研究，但應(yīng)用于植物上的研究還甚少。本研究采用基因組DNA混合池技術(shù)，通過構(gòu)建6個桉樹樣品的基因組DNA混合池快速篩選EST-SSR標記，并與常規(guī)方法篩選方法進行驗證，為林木SSR引物的大量開發(fā)提供一種新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

設(shè)計的引物由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司公司合成。本實驗所用桉樹葉片采集于國家南方重要種苗基地和廣東省雷州林業(yè)局，其中細葉桉（1號）、巨桉（2號）和粗皮桉（6號）采集于廣東省遂溪縣南方國家級重要種苗基地，尾葉桉（3號）、赤桉（4號）和檸檬桉（5號）采集于廣東省雷州市。

1.2 ET-SSR標記的引物選擇

1.2.1 EST數(shù)據(jù)的獲得和預(yù)處理

從美國NCBI公共數(shù)據(jù)庫dbEST提供的桉樹EST序列中下載了2010年和2011年更新（截至2011.11.7）的EST序列共16566條，其中巨桉16008條，藍桉558條。

在開發(fā)之前需要對下載的數(shù)據(jù)進行預(yù)處理，包括去除一些低質(zhì)量的片段（＜100 bp）和帶有少量載體序列及末端存在polyA/T“尾巴”的序列。這些數(shù)據(jù)會影響相關(guān)信息的分析。只有無冗余的EST數(shù)據(jù)庫的SSR頻率才能更真實的反應(yīng)SSR在基因組轉(zhuǎn)錄部分的密度。本實驗利用DNAStar軟件下的SeqManⅡ操作系統(tǒng)對所有下載的序列分別樹種進行去冗拼接和聚類。

1.2.2 EST-SSR位點的查找及引物的設(shè)計和評估

利用SSRHunter軟件對Contigs序列進行SSR位點查找。查找標準為含有2,3,4,5,6堿基重復(fù)的SSR位點，其重復(fù)次數(shù)分別不小于9,6,5,4,3，即堿基重復(fù)至少要達到18個堿基長度。

對所有篩選出的含有SSR位點的Contigs序列利用Primer5.0軟件進行引物設(shè)計。引物設(shè)計遵循3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補；其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)； 再次引物不能在模板的非目的位點引發(fā)DNA聚合反應(yīng)（即錯配)。最后利用Oligo6.0軟件對所設(shè)計出的引物進行評價分析并篩選出評價高的引物，評價分析的標準為：1) ΔG值反映了序列與模板的結(jié)合強度，最好引物的ΔG值在5′端和中間值比較高，而在3′端相對低。2) Tm值曲線以選取72℃附近為佳，5′到3′的下降形狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。3) Frq曲線揭示了序列片段存在的重復(fù)機率大小。選取引物時，宜選用3′端Frq值相對較低的片段。

1.3 基因組DNA提取與混合池構(gòu)建

桉樹葉片樣品的DNA提取采用QIAGEN公司的植物DNA基因組提取試劑盒（DNeasy Plant Mini kit）。 取 DNA 樣 品 3.0 μL 與 1.0 μL 6×Loading Buffer混勻后用1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測DNA樣品濃度，檢測染料為GelRedTM(100ml瓊脂糖凝膠加3μL)，用100 bp DNA ladder標定，初步判斷2μL中含有DNA的量，然后根據(jù)檢測結(jié)果稀釋DNA，以供后續(xù)PCR擴增實驗用，并保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

將6個桉樹基因組DNA樣品等量混合，構(gòu)建一個基因組DNA混合池，取混合池樣品3.0 μL與1.0 μL 6×Loading Buffer混勻后用1.5%瓊脂糖凝膠上電泳檢測其濃度，根據(jù)DNA樣品濃度稀釋混合池樣品，供后續(xù)實驗利用。

1.4 EST-SSR引物的篩選

1.4.1 SSR-PCR擴增體系優(yōu)化及引物快速篩選

以各樣品的基因組濃度一致的基因組DNA混合池為模板進，擴增體系參照李發(fā)根[19]設(shè)計的SSR引物篩選程序進行PCR優(yōu)化和擴增。通過調(diào)整EST-SSR引物的Mg2+濃度和退火溫度（Tm）來進行PCR優(yōu)化，使擴增產(chǎn)物具有較好的特異性及較高的濃度。20 μL的PCR反應(yīng)體系中，Mg2+濃度設(shè)置為1.5、2.0、2.5 mmol 3個梯度，退火溫度（Tm）設(shè)置為50、56、60℃ 3個梯度。先將所有引物在Mg2+濃度為2.5 mmol、Tm為56℃條件下進行擴增，PCR擴增產(chǎn)物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測和凝膠成像觀察，擴增結(jié)果為明顯的單一條帶或兩條條帶，其中亮帶較弱帶強2倍以上的引物保留。再將剩下的引物繼續(xù)在Mg2+濃度為2.0 mmol或1.5 mmol條件下進行第二輪擴增，保留結(jié)果較好的引物。最后改變Tm溫度為50℃或60℃條件，并與三種Mg2+濃度相互交叉，反復(fù)篩選，每一輪篩選保留擴增結(jié)果較好的引物，篩選到最后仍然得不到較理想擴增產(chǎn)物的引物舍棄。具體的PCR擴增體系如表一所示。

表1 20 μL PCR反應(yīng)體系Table 120μL PCR reaction system

PCR擴增循環(huán)條件是： 94℃預(yù)變性4 min；94℃變性30 s，Tm退火（56℃、50℃、60℃）30s，72℃延伸1min（35個循環(huán)）；?72℃后延伸10 min。

2.4.2 常規(guī)EST-SSR引物篩選與快速篩選的對比分析

常規(guī)引物篩選是對代表性的基因組DNA樣品（6個）進行篩選驗證。本實驗安排了在快速篩選實驗中隨機選出3對擴增結(jié)果好的引物（eSSR-GR029、eSSR-GR035、eSSR-GR074）進行常規(guī)PCR技術(shù)篩選驗證；同時，在快速篩選實驗中隨機選出3對擴增結(jié)果不好的引物（eSSR-GL001、eSSR-GR010、eSSR-GR117）進行常規(guī)PCR篩選驗證。擴增體系及循環(huán)條件與快速篩選實驗相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA樣品濃度的檢測

由QIAGEN公司的基因組提取試劑盒（DNeasy Plant Mini kit）提取的桉葉DNA質(zhì)量較好，沒有條帶拖尾和雜帶的現(xiàn)象。圖1為6個桉樹DNA樣品和DNA混合池樣品的電泳檢測圖，點樣為 3.0 μL 與 1.0 μL 6 × loading buffer的混合。由圖可得到，1、2、3號桉樹DNA樣品的濃度比較一致，4、5、6號桉樹DNA樣品的濃度比較一致。按照基因組DNA樣品終濃度10 ng/μL，將1、2、3號樣品稀釋一倍后與4、5、6號樣品等量混合，待用。

圖1 桉葉基因組DNA提取電泳效果Fig. 1Eucalyptus genomic DNA detected by electrophoresis

2.2 EST-SSR引物設(shè)計

經(jīng)軟件分析含有SSR位點的可以用來設(shè)計引物的EST-Contigs序列一共有820條，其中藍桉的序列有24條，巨桉的序列有796條。隨機挑選部分設(shè)計引物，共設(shè)計EST-SSR引物150對用于本次實驗，其中由藍桉的EST序列設(shè)計的引物有9對，由巨桉的EST序列設(shè)計的引物有141對。EST-SSR引物長度均為18～22bp，引物設(shè)計的目的片段大小均為200～500 bp。

2.3 EST-SSR引物快速篩選的PCR體系優(yōu)化

經(jīng) PCR 擴增后，取其產(chǎn)物 3.0 μL 與 1.0 μL 6× Loading Buffer混合用來電泳檢測，選取擴增出明亮單一或者有兩條條帶，其中亮帶比弱帶強2倍以上的片段的引物，該引物可以直接用來后續(xù)實驗，其余雜帶較多，條帶比較模糊的引物或者無條帶的引物都要進行Mg2+濃度和Tm退火溫度的優(yōu)化。如圖2，其中豎箭頭指出的是較好的條帶，橫箭頭指的是100 bp DNA Ladder。

圖2 部分EST-SSR引物快速篩選Fig. 2Fast screening result of partial EST-SSR primers

3.4 EST-SSR引物快速篩選分析

9輪PCR體系優(yōu)化的篩選后，成功擴增的引物有136對，獲得比較單一明亮的片段，擴增成功率達90.667%。說明了藍桉和巨桉的EST序列在桉樹種中的通用性較好。從表1中可以得到，第一輪篩選（2.5 mmol和56℃）和第二輪篩選（2.0 mmol和56℃），基本成功擴增的就達到了70.667%，與李發(fā)根[19]和郭勇[20]中的引物篩選結(jié)果相一致，其余擴增效果不好的進入下一輪的篩選。

表1 EST-SSR引物篩選結(jié)果Table 1The results of EST-SSR primer screening

圖3 eSSR-GR029、eSSR-GR035、eSSR-GR074三對引物單一樣本擴增效果Fig.3Three pairs primers (eSSR-GR029, eSSR-GR035, eSSR-GR074) single template PCR detected by electrophoresis

圖4 eSSR-GL001、eSSR-GR010、eSSR-GR106引物單一樣品擴增效果Fig.4 Primers(eSSR-GL001, eSSR-GR010, eSSR-GR106)single sample PCR detected by electrophoresis

2.5 引物常規(guī)篩選與快速篩選的比較分析

在與快速篩選相同體系和循環(huán)條件下，進行了6對引物的常規(guī)篩選驗證，3對為快速篩選結(jié)果較優(yōu)的引物，其余3對為快速篩選中結(jié)果較差的引物。如圖3分別為eSSR-GR029、eSSR-GR035、eSSR-GR074用6個DNA樣品PCR擴增后的產(chǎn)物檢測圖。圖中，第一個白色箭頭指的是3(a)為引物eSSR-GR029的單一樣品逐一擴增圖，引物在1、2、3、4、6號樣品中擴增效果都比較好，在DNA混合樣品中也有很好的擴增效果，但5號樣品的擴增效果不佳；3(b)為引物eSSR-GR035的單一樣品逐一擴增圖，引物在6個樣品中的擴增效果都比較好；3(c)位引物eSSR-GR074的單一樣品逐一擴增圖，引物在1、2、3、6號和DNA混合樣品中都有很好的效果，但4號和5號樣品基本檢測不到條帶。圖4為 eSSR-GL005、eSSR-GR010、eSSR-GR106用6個DNA單一樣品和DNA混合池逐一PCR擴增后的產(chǎn)物檢測圖，其中，白色箭頭指的是DNA混合池樣本PCR擴增后的產(chǎn)物。由圖可看出，三對引物的擴增效果在單一樣本和DNA混合池中均不理想，都沒有出現(xiàn)明顯的單一條帶，得到的條帶模糊不清晰，兩種方法得到的結(jié)果一致，eSSR-GL005、eSSR-GR010、eSSR-GR106不是理想的引物。

3 結(jié)論與討論

本研究基于基因組DNA混合池技術(shù)，建立了一種適用于EST-SSR標記特異性引物的快速高效篩選方法，適用率達到83.33%，工作量比常規(guī)單樣本逐一篩選引物方法降低了約80%。

（1）基因組DNA混合池的構(gòu)建。本實驗中基因組DNA混合池是選用的6個桉樹基因組DNA樣品進行等量混合，保證了各個樣品在混合池中的濃度和數(shù)量，使得構(gòu)建出來的DNA混合池能夠相等的代表其中的6個樣品。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測得到的濃度也充分顯示出構(gòu)建的DNA混合池與六個樣品的濃度和片段大小都比較一致，可以作為模板進行PCR擴增篩選引物。

（2）基因組DNA混合池的引物快速篩選的可靠性。本實驗中采用的是6種常見桉樹的DNA樣品作為模板進行混合構(gòu)建的DNA混合池，并以混合池為PCR擴增反應(yīng)的模板進行EST-SSR引物的篩選。從篩選結(jié)果可以得出，DNA混合池模板PCR擴增的條帶清晰明亮，與各樣品分開PCR擴增得到的條帶，片段大小和條帶清晰度一致。在常規(guī)篩選實驗中，三對較好引物的條帶在1號（細葉桉），2號（巨桉）,3號（尾葉桉），6號（粗皮桉）四種桉樹中條帶均單一明亮，通用性很好。4號（赤桉）在eSSR-GR074中沒有條帶出現(xiàn)，5號（檸檬桉）在eSSR-GR029和eSSR-GR074兩對引物中都沒有條帶出現(xiàn)，適用率達到83.33%。

（3）基于基因組DNA混合池的EST-SSR引物快速篩選方法的效率及適應(yīng)性。本方法的研究基礎(chǔ)是基于基因組DNA混合池技術(shù)與簡單重復(fù)序列（SSR）研究的相結(jié)合[14,18-19]。由于SSR標記技術(shù)屬于特異性引物的分子標記技術(shù)[20]，對DNA模板的要求不是很高，而且結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好[21-27]，利用基因組DNA混合池代替各個樣本進行PCR反應(yīng)，滿足SSR標記技術(shù)對DNA模板的要求。因此，具有特異性引物的分子標記技術(shù)，使用DNA混合池可以進行引物的快速篩選。

常規(guī)SSR引物的篩選，為保障有效性需對至少5個樣本逐一進行PCR擴增反應(yīng)，對于大量的引物設(shè)計，工作量非常大，且消耗大量基因組DNA樣品。使用DNA混合池對大量引物進行篩選，工作量僅為原來工作量的約五分之一，能切實有效的提高工作效率，顯著降低基因組DNA消耗和實驗成本。

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Studies on quick screening of EST-SSR primers based on genomic DNA mixing pool

LIU Guo1, XIE Yao-jian1, ZHANG Dang-quan2, GU Zheng-jun2
(1.China Eucalypt Research Centre, Zhanjiang 524022, Guangdong, China; 2.a. Hunan Provincial Key laboratory of Forestry biotechnology; 2b. Key Laboratory of Non-wood Forest Products of State Forestry Ministry; 2c. Key Laboratory of Non-wood Forest trees and protection of Ministry of Education, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

The screening of SSR primers for forestry is a heavy research which is very time consuming and consume intensive experimental materials. By employing genomic DNA pooling technology, a method of mixing several genomic DNA templates equivalently as the single template for PCR, was used to quickly screen SSR primers, which will signif i cantly reduce the experimental workload and cost. Genomic DNA pooling constructed by equivalently mixing 6 Eucalyptus genomic DNA templates was used to screen 150 pairs of EST-SSR primers. The analytical results show that comparing with conventional screening method, the genomic DNA pooling method can greatly shorten experimental period and signif i cantly reduce the consumption of genomic DNA, suggesting that this method is a fast and eff i cient method for screening substantive SSR primers used in trees.

genomic DNA mixing pool; primer screening; EST-SSR; PCR

S792.39

A

1673-923X(2012)09-0124-06

2012-08-15

林業(yè)公益性行業(yè)專項（201104003）；863課題（2011AA100202）；湖南省科技廳重點項目（2010NK2008，2011NK2019）；國家863計劃課題（2011AA100203）

劉 果(1988-)，女，碩士生，研究方向為林木遺傳育種；Email：liuguopz@163.com

謝耀堅，男，博士，研究員，研究方向為林木遺傳育種；Email：Xieyj@21cn.com

[本文編校：歐陽欽]