謝康

(深圳市計量質(zhì)量檢測研究院，廣東 深圳 518000）

1 可見分光光度計的原理

可見分光光度計是一種結(jié)構(gòu)簡潔、使用方便的單光束分光光度計，基于樣品對單色光的選擇吸收特性可用于對樣品進行定性和定量分析。其原理是：當一束單色光照射待測物質(zhì)的溶液時，當某一定頻率(或波長)的可見光所具有的能量(hf)恰好與待測物質(zhì)分子中的價電子的能級差相適應(yīng)(即ΔE=E2-E1=hf)時，待測物將對該頻率(波長)的可見光產(chǎn)生選擇性的吸收。用可見分光光度計可以測量和記錄其吸收程度 (吸光度)。由于在一定條件下，吸光度A與待測物質(zhì)的濃度C及吸收地長度l的乘積成正比，即A＝KCL，所以，在測得吸光度 A后，可采用標準曲線法、比較法以及標準加入法等方法進行定量分析。

2 檢定前對儀器波長進行粗略檢查

可見分光光度計的波長準確度是很重要的；特別在比較儀器時，波長準確度顯得更加重要。因為物質(zhì)對不同波長的光吸收時，有不同的摩爾吸光系數(shù)。我們知道，分光光度計分析測量的原理是基于郎伯-比爾定律，其數(shù)學表達式為：

A=-lg（I/I0）=-lgT=klc

其中：

A-物質(zhì)的吸光度

I0-入射的單色光強度、

I-透射的單色光強度

T-物質(zhì)的透射比

k-物質(zhì)的吸光系數(shù)

l-被分析物質(zhì)的光程

c-物質(zhì)濃度

郎伯-比爾定律適用的前提條件是單色光，從公式中可以看出如果光的波長發(fā)生變化，將直接影響吸光度及物質(zhì)濃度的測量結(jié)果，由此可見光的波長示值誤差在分光光度計檢定與使用中的重要性。針對某些廠礦企業(yè)實驗室環(huán)境條件差，磁場、震動、腐蝕性氣體對儀器的影響且使用比較頻繁，容易造成儀器出現(xiàn)故障的情況，為了提高工作質(zhì)量和效率，在檢定前，應(yīng)首先粗略檢查儀器的光路，如果沒有大的問題，可進一步按規(guī)程進行檢定，如果不符合要求，應(yīng)先粗略調(diào)整光路后再進行檢定，這樣可提高工作效率，收到事半功倍的效果，具體的方法是：

將儀器波長置于580nm處，狹縫置于2 nm處（如果是可見分光光度沒有必要），打開試樣室蓋，用一張白紙插入?yún)⒈裙饴坊驑悠返墓饴分醒耄@時在白紙上應(yīng)看到一個清晰明亮完整的長方形橙黃色光斑。在紫外區(qū)一樣，應(yīng)看到一個亮度稍暗的長方形橙黃色光斑，當手動波長向長波方面變動時，應(yīng)看到光斑的顏色由黃變紅，繼之當手調(diào)波長向短波方面時，應(yīng)看到光斑顏色由紅變黃向紫色變化。如果儀器波長檢測能如上所述順利完成，則說明儀器光路基本正常，波長示值誤差應(yīng)在2nm范圍以內(nèi)。

3 儀器波長調(diào)整后，要通知該儀器操作人員

在定量分析中，雖然出現(xiàn)了許多功能先進的分光光度計，但在企業(yè)的一線分析中，更多的仍是采用標準曲線法，它是基于求得一組標準溶液所對應(yīng)的吸光度與被測樣品的吸光度進行比較，而得到被測物質(zhì)含量的一種方法，也是分光光度法定量分析中最經(jīng)典的方法，它的理論依據(jù)仍是郎伯-比爾定律。在檢定中，如果發(fā)現(xiàn)儀器波長示值超差，需要調(diào)整，在調(diào)整波長后，檢定人員如果沒有及時告知對方，對方可能仍使用以前的標準曲線，就會造成檢測結(jié)果嚴重偏離?？梢娨欢ㄒ皶r告訴該儀器操作人員或質(zhì)管人員，波長調(diào)整后應(yīng)重新繪制標準曲線才能進行下一次檢測，否則檢測結(jié)果將會出現(xiàn)較大偏差或失誤。因為原標準曲線是在波長調(diào)整前繪制的，現(xiàn)在波長調(diào)整后，與原來相比吸光度將隨之發(fā)生變化，可見檢測結(jié)果不單純與儀器有關(guān)，與標準溶液的選擇、配制、稱量以及如何正確使用儀器等方面都有關(guān)系。

4 要重視對比色皿成套性的檢定

在分光光度計的檢定中，我們往往重視對儀器本身的檢定，而容易忽視對儀器配套使用的比色皿成套性的檢定，這也是造成儀器分析結(jié)果偏離或超差的一個重要因素。很多企業(yè)操作人員由于對儀器結(jié)構(gòu)及分析原理了解不夠，也容易忽視這一問題，從公式中不難看出，如果比色皿杯子的尺寸以及透光性發(fā)生變化，將直接影響檢測結(jié)果的準確性。在檢定中，有時會遇到企業(yè)反映檢測結(jié)果有問題，懷疑是儀器波長超差，但到現(xiàn)場經(jīng)我們認真反復對儀器進行檢定后，發(fā)現(xiàn)儀器各項技術(shù)指標沒有大的問題，基本符合規(guī)程的要求，再檢查溶液的配制，也沒有發(fā)現(xiàn)較大的問題，最后發(fā)現(xiàn)配套使用的兩個比色皿杯，從外觀上看顏色深淺不一致，經(jīng)檢定后發(fā)現(xiàn)兩個比色皿示值誤差在10%左右，嚴重超差。經(jīng)詢問得知，造成這兩個杯子顏色不一致的原因是：企業(yè)操作人員習慣做法是盛放參比溶液與盛放樣品溶液的比色皿長期固定不變且不注意及時清洗，因而造成盛放樣品溶液的比色皿杯由于污染程度相對嚴重而使比色皿表面顏色變深，久而久之，兩個比色皿透射比出現(xiàn)較大的誤差。針對這一情況，我們告訴企業(yè)操作人員，配套使用盛參比液比色皿與盛樣品溶液的比色皿杯不是固定不變的，可以互換使用，但必須保持清潔，用完后應(yīng)及時用蒸餾水作參比檢查其成套性，其誤差不應(yīng)超過0.5%，這一點在規(guī)程上是有明確規(guī)定的。另外，比色皿透光面如遭到污染，應(yīng)使用蒸餾水緩緩沖洗，然后再用潔凈而干燥的細布或?qū)Ｓ苗R頭紙輕輕擦凈，最好不要用毛刷或濾紙等硬性物質(zhì)擦拭，以免出現(xiàn)劃痕，造成比色皿報廢，使用完畢后，一定要及時給予清洗。清洗時，可用微量濃度的酸或一定濃度有機溶劑浸泡清洗，然后用蒸餾水沖洗，最后應(yīng)在干凈的環(huán)境中風干，切勿用熱風烘烤吹干，以免使吸收池形狀、尺寸發(fā)生微小變化，因而影響光程直至檢測結(jié)果。

5 檢定用計量標準爭取得到更多的的信息，以便靈活使用

我們在檢定中發(fā)現(xiàn)，制藥行業(yè)使用紫外分光光度計較多，且大多數(shù)是進口儀器，自動化程度高，企業(yè)經(jīng)常會根據(jù)檢品的需要和《藥典》的規(guī)定，往往對儀器設(shè)定好使用條件，讓操作人員按部就班地操作，不允許隨意改變設(shè)定條件，以免儀器出現(xiàn)故障影響生產(chǎn)，這對企業(yè)管理來說是一件好事，但有時會給我們檢定工作帶來一定的困難，如何在這種情況下進行檢定工作，就需要我們靈活地使用檢定規(guī)程。比如，大多數(shù)藥廠使用紫外分光光度計，參考結(jié)果經(jīng)常是吸光度值而不是透射比值，而我們的規(guī)程和檢定證書按常規(guī)給出的值卻是透射比值，這就為工作帶來不便。雖然二者之間可以互相換算，但在現(xiàn)場檢定中，為了更快、更便捷地了解儀器，我們的計量標準在上級部門檢定時，如果能在給出透射比標準值的同時再給出吸光度標準值更好。近年來，我們通過和上級檢定部門溝通，吸光度和透射比這兩個標準值同時給出，方便了現(xiàn)場工作。

6 波長檢定時應(yīng)注意事項

在波長檢定時，對于非自動掃描儀器如721型、722型、751型、752型等儀器，檢定規(guī)程僅說明在波長檢定點附近單向逐點測出標準物質(zhì)的透射比或吸光度，而沒有明確說明檢定時波長是從低到高進行還是從高到低進行為好。事實上二者均可以實施，但在具體操作時是不同的。對于從事檢定工作時間不長的檢定員來說，后者操作有可能造成儀器光源或光電接收系統(tǒng)故障。所以，一般情況下，我們盡量選擇從低波長點向高波長點逐漸進行，這樣光源強度是由弱到強、由小到大成漸進變化，對儀器光電接收系統(tǒng)起到有益的保護作用，而不是由強到弱或由弱到強突變刺激儀器，以免對儀器光源和光電接收系統(tǒng)造成意外故障，給檢定工作帶來不便。

7 更換光源時應(yīng)注意事項

對于721型可見分光光度計,鎢燈更換時除要仔細檢查電源線和鎢燈頭焊點是否接觸良好,還要注意燈絲豎線要垂直正確對準橢圓形光窗,然后調(diào)整波長至580nm，再調(diào)整燈架上的螺釘上下、前后、左右，直至能在比色皿槽看到方正明亮的橘黃色光斑。對于插拔件燈泡來說，例如722型、723型、752型等相對容易，一般情況僅需要調(diào)整燈的上下位置，使580nm時長方形黃色光斑中心照在入射狹縫上即可。在更換氘燈時波長仍調(diào)在580nm，狹縫調(diào)至最大，調(diào)整氘燈位置應(yīng)能在狹縫上看到微弱且完整的長方形橘黃色光斑，但應(yīng)注意在更換氘燈時最好戴上防紫外線眼鏡，以免長時間工作眼睛被灼傷。如果沒有防護眼鏡，要快速、短時間看準位置調(diào)整、或稍停片刻讓眼睛休息后再調(diào)整。

結(jié)束語

綜上所述，分光光度計屬于實驗室計量儀器的一種，按國家標準必須定期檢定，進行量值溯源。只有熟練地操作儀器，定期檢定，才能確保儀器波長的精確度，從而才能保證測定的準確性，同時還能及時發(fā)現(xiàn)儀器存在的問題。

[1] 吳文銘，紫外可見分光光度計的及其應(yīng)用[J].生命科學儀器，2009.07.

[2] 袁波，趙海鷹，竇曉鳴.紫外可見分光光度計的發(fā)展與現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代科學儀器，2004.03.