張文舉 許慶金 鄧志瑞 陳 沁

（上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444）

芝麻過(guò)敏原PCR檢測(cè)方法

張文舉 許慶金 鄧志瑞 陳 沁

（上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200444）

芝麻是重要的食品過(guò)敏原之一，微小劑量即可引起嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)。針對(duì)芝麻過(guò)敏蛋白－2S白蛋白的基因序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，建立并優(yōu)化芝麻過(guò)敏原檢測(cè)的普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Realtime PCR）方法。結(jié)果表明，兩種方法的最低檢測(cè)限分別為0.1，0.01ng DNA，該方法特異性良好，成本較低，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

芝麻；過(guò)敏原；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；2S白蛋白

食物過(guò)敏（food allergy）是食物刺激有機(jī)體產(chǎn)生的變態(tài)反應(yīng)，嚴(yán)重者可在幾分鐘內(nèi)引起多種器官出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)，甚至導(dǎo)致個(gè)體休克或死亡［1］。發(fā)達(dá)國(guó)家每年有超過(guò)3%的成年人，6%～8%的兒童受各種過(guò)敏性疾病的困擾［2］。芝麻是常見(jiàn)的食物過(guò)敏原之一［3，4］。芝麻中含有多種過(guò)敏蛋白，比較重要的是：缺少硫元素的2S白蛋白（Ses i 1），富含硫元素的2S白蛋白（Ses i 2），7S球蛋白（Ses i 3）［5，6］，2種油質(zhì)蛋白（Ses i 4和Ses i 5）［7］以及2種11S球蛋白（Ses i 6 和 Ses i 7）［8］等。其中2S白蛋白是最主要的致敏成分［9］。

芝麻過(guò)敏已引起世界各國(guó)的關(guān)注，日本、澳大利亞和西方國(guó)家要求含有芝麻成分的食品包裝上必須含有芝麻過(guò)敏標(biāo)示，以防止有芝麻過(guò)敏體質(zhì)的人群誤食［9］，因此，快速有效地檢測(cè)食品中可能含有的芝麻成分是防止芝麻過(guò)敏的有效手段。目前主要檢測(cè)芝麻過(guò)敏原的方法有SDS－PAGE、HPLC和HPLC－MS等［10］。這些方法直接檢測(cè)過(guò)敏蛋白，但食品加工易導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的破壞，影響檢測(cè)準(zhǔn)確性；同時(shí)有研究［11，12］證實(shí)變性后的部分蛋白可與抗體結(jié)合引起假陽(yáng)性，此外，上述方法存在檢測(cè)周期較長(zhǎng)，不穩(wěn)定性因素多，工作量大等缺點(diǎn)［13］。而食品中存在的基因組DNA更穩(wěn)定且不易受食品加工的影響，因此基于基因組DNA開發(fā)的PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的成功應(yīng)用在一定程度上可解決上述問(wèn)題。鑒于此，本試驗(yàn)針對(duì)芝麻中的主要過(guò)敏原－2S白蛋白的基因序列設(shè)計(jì)引物，建立了用于芝麻過(guò)敏原檢測(cè)的PCR方法。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

芝麻、花生、黃豆、黑豆、紅豆、綠豆、白豆、豌豆、大麥、小麥、蕎麥、燕麥、大米、小米、紅米、玉米、榛子：均購(gòu)自上海某超市；

dNTPs、Taq酶，10×反應(yīng)緩沖液（含 Mg2＋）和熒光定量反應(yīng)混合液：天根生物科技（北京）有限責(zé)任公司；

乙醇、三氯甲烷：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

異丙醇：分析純，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；

異戊醇：分析純，上?；瘜W(xué)試劑有限公司

氯化鈉：99.9%，上海生工生物工程有限公司；

瓊脂糖 VI：AB0045－100C，上海生工生物工程有限公司；

十六烷基三甲基溴化胺（CTAB），十二烷基硫酸鈉（SDS）：99.0%，上海生工生物工程有限公司；

三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）：99.9%，上海生工生物工程有限公司；

乙二胺四乙酸、乙酸：分析純，上海豪申化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器

電泳儀：Tanon EPS 300A，上海天能科技有限公司；

凝膠成像系統(tǒng)：Tanon 3500，上海天能科技有限公司；

電子天平：PB602－N，梅特勒－托利多集團(tuán)；

離心機(jī)：Pico 17，德國(guó)賀利氏有限公司；

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀：S1000Thermal Cycler，伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀：ICycler Thermal Cycler（iQ5），伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司。

1.2 試驗(yàn)方法

引物由上海生工生物工程有限公司合成；TES溶液：Tris溶液（100mM，pH＝8.0），EDTA 溶液（10mM），2%SDS溶液；SEVGA溶液（氯仿∶異戊醇＝24∶1）；其他試劑按常規(guī)方法配制。

1.2.1 DNA的提取 芝麻DNA的提取方法參照Chen［14］，Moller［15］等的方法并稍作修改：

（1）液氮中研磨種子，取0.1g于1.5mL Eppendorf管中，加入500μL TES溶液和7μL Proteinase K溶液（0.01mg/μL）混勻，置于55℃水浴鍋中，水浴60～120min，期間混勻幾次；

（2）取出水浴后的上述溶液，調(diào)節(jié)其鹽濃度至1.4M，加入1/10體積的CTAB溶液（10%），置于65℃水浴10min；

（3）待水浴后，取出，加入等體積SEVGA溫和混勻，12 000r/min離心10min，取上清；

（4）加入3μL RNase A于上清液中，37℃水浴30min；

（5）取出水浴后的溶液，加入等體積－20℃預(yù)冷的異丙醇，－20℃放置40min以上，13 000r/min離心15min，棄上清；

（6）向得到的沉淀中加入500μL 70%乙醇，懸浮洗滌后12 000r/min離心5min，去上清；

（7）加入200μL 70%乙醇于得到的上述沉淀，去上清；

（8）向得到的沉淀中加50μL雙蒸水溶解，測(cè)DNA濃度和純度，分裝，低溫（－20℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 針對(duì)芝麻2S白蛋白的基因序列（FJ222624.1），運(yùn)用軟件Primer Primier5.0設(shè)計(jì)引物Ses F/Ses R（表1），預(yù)計(jì)PCR擴(kuò)增的目的條帶大小為126bp，該引物可用于普通PCR和Real－time PCR檢測(cè)體系。

1.2.3 PCR反應(yīng)體系和條件 普通PCR擴(kuò)增總體系20μL，含 2μL PCR buffer（Mg2＋plus），3.2μL dNTPs（2.5mM），2μL DNA模板，2μL引物（each 3μM），0.4μL Taq酶（2.5U/mL），10.4μL雙蒸水；PCR反應(yīng)條件：94℃30s，54.6 ℃ 30s，72 ℃ 15s，30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像系統(tǒng)上分析結(jié)果。

Real－timePCR擴(kuò)增體系如下：2μL DNA模板，2μL引物（1.5μM），9μL熒光定量反應(yīng)混合液，加雙蒸水至20μL；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀反應(yīng)條件：94℃ 10s，54.6℃20s，72℃20s，40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)結(jié)果由實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀自帶軟件分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響

設(shè)定不同DNA濃度進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，隨著DNA濃度的降低，目的條帶強(qiáng)度越來(lái)越弱；當(dāng)DNA用量為10ng時(shí)，條帶亮度適中，清晰度較好；但小于10ng時(shí)，目的條帶較弱。因此選定10ng作為后續(xù)試驗(yàn)DNA的用量。

圖1 DNA含量對(duì)PCR擴(kuò)增的影響Figure 1 Effect of DNA concentrations on PCR amplification

2.2 引物濃度、退火溫度及循環(huán)數(shù)對(duì)PCR擴(kuò)增的影響

引物濃度、循環(huán)數(shù)及退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響見(jiàn)圖2。

由圖2（a）可知，隨著引物濃度的降低，目的條帶的強(qiáng)度越來(lái)越弱，在0.25μM時(shí)目的條帶已經(jīng)相對(duì)較弱。為保證電泳結(jié)果的清晰度，選擇0.5μM作為后續(xù)試驗(yàn)的引物濃度。

由圖2（b）可知，當(dāng)循環(huán)數(shù)為25時(shí)，目的條帶強(qiáng)度較弱；而當(dāng)循環(huán)數(shù)為35時(shí)，其目的條帶強(qiáng)度與循環(huán)數(shù)為30時(shí)相差不大。對(duì)于一般PCR擴(kuò)增而言，循環(huán)數(shù)較高時(shí)相對(duì)更容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，因此選擇循環(huán)數(shù)30開展后續(xù)的試驗(yàn)。

由圖2（c）可知，當(dāng)退火溫度低于54.6℃時(shí)，目的條帶強(qiáng)度相對(duì)較強(qiáng)。而對(duì)于一般PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō)，相對(duì)較低的退火溫度更易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。為保證擴(kuò)增條帶的亮度和特異性，本試驗(yàn)選擇54.6℃作為后續(xù)試驗(yàn)的退火溫度。

2.3 PCR擴(kuò)增的特異性及靈敏度檢驗(yàn)

以芝麻基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，選取其他16種常見(jiàn)的食品提取DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖3（a）可知，只有以芝麻DNA為模板的PCR擴(kuò)增出現(xiàn)目的條帶，其他均未出現(xiàn)目的條帶，表明該引物具有良好的特異性。

圖2 引物濃度、循環(huán)數(shù)及退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響Figure 2 Effect of primer concentrations，cycles and annealing temperatures on PCR amplification

圖3 PCR方法的特異性及靈敏度Figure 3 Specificity and sensitivity of PCR method

在PCR擴(kuò)增體系中，對(duì)10ng DNA依次進(jìn)行10倍稀釋，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖3（b）可知，隨著DNA用量的降低目的條帶越來(lái)越弱；大于0.1ng時(shí)均有明顯的目的條帶出現(xiàn)；而小于0.1ng時(shí)則沒(méi)有清晰的目的條帶。因此，本試驗(yàn)建立的普通PCR方法的最低檢測(cè)限是0.1ng DNA。

2.4 Real－time PCR擴(kuò)增體系的建立

以芝麻基因組DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，提取其他16種常見(jiàn)食品的DNA并進(jìn)行Real－time PCR擴(kuò)增。由圖4（a）可知，只有芝麻基因組DNA出現(xiàn)了熒光擴(kuò)增信號(hào)，而其他未出現(xiàn)熒光信號(hào)，表明該引物擴(kuò)增特異性良好，適合Real－time PCR方法檢測(cè)芝麻過(guò)敏原。

使用10倍稀釋的芝麻 DNA（100，10，1，10－1，10－2，10－3，10－4ng）進(jìn)行 Real－time PCR擴(kuò)增并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖4（b）可知，在DNA含量大于0.01ng時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果具有較好的重復(fù)性，且不同濃度DNA的擴(kuò)增結(jié)果線性良好，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量關(guān)系式：

式中：

y——Ct值；

x——DNA質(zhì)量的自然對(duì)數(shù)值。

而當(dāng)DNA含量低于0.01ng時(shí)，擴(kuò)增不能得到良好的重復(fù)性，而且不能與前述結(jié)果形成良好的線性。因此，該Real－time PCR體系的檢測(cè)限為0.01ng芝麻基因組DNA。

2.5 實(shí)際商品檢驗(yàn)

圖4 芝麻DNA Real－time PCR檢測(cè)體系的建立Figure 4 Establishment of the Real－time PCR method to detect sesame DNA

在優(yōu)化條件后，以芝麻基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，提取17種市售商品的DNA并進(jìn)行普通PCR和Real－time PCR擴(kuò)增。由表2可知，對(duì)于標(biāo)示中可能含有芝麻成分的3種餅干類食品（C1，C3，C4），普通 PCR和 Real－time PCR方法檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，與標(biāo)示相符；而對(duì)于所有未標(biāo)示含有芝麻成分的巧克力類（C7～C12）和醬類食品（C13～C17）檢測(cè)結(jié)果均為陰性，亦與標(biāo)示相符。此外，在一種未標(biāo)示含有芝麻成分的餅干類食品（C5）中，兩種PCR方法的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，表明其含有芝麻過(guò)敏原成分，而標(biāo)簽中未表明這點(diǎn)。

表2 實(shí)際商品中芝麻過(guò)敏原的檢測(cè)+Table 2 Detection of sesame allergen in commodities

3 討論

影響PCR擴(kuò)增的因素很多，本試驗(yàn)針對(duì)其中4個(gè)主要參數(shù)（模板DNA用量，引物濃度，循環(huán)數(shù)和退火溫度）進(jìn)行了優(yōu)化。只有適宜的模板DNA用量和引物濃度才能得到理想的擴(kuò)增條帶，而過(guò)低的模板量和引物濃度會(huì)使得擴(kuò)增效率低下；模板DNA過(guò)量時(shí)引物會(huì)過(guò)早耗盡，可能導(dǎo)致出現(xiàn)彌散狀背景［16］；過(guò)高的引物濃度傾向于形成非特異性產(chǎn)物，同時(shí)形成大量引物二聚體。在本試驗(yàn)中，當(dāng)DNA用量為10ng，引物濃度為0.5μM時(shí)PCR擴(kuò)增條帶單一，亮度適中，可用于后續(xù)試驗(yàn)。退火溫度對(duì)于PCR擴(kuò)增的特異性和效率具有重要影響，試驗(yàn)結(jié)果表明在一定的溫度范圍內(nèi)（48～65℃），擴(kuò)增效果良好，而當(dāng)退火溫度低于54.6℃時(shí)，目的條帶強(qiáng)度相對(duì)較強(qiáng)，同時(shí)考慮到較低的退火溫度容易引起非特異性擴(kuò)增，為了保證目的條帶的亮度和PCR的特異性，選擇54.6℃作為最終的退火溫度。循環(huán)數(shù)對(duì)于PCR擴(kuò)增的影響較為明顯，本試驗(yàn)中，當(dāng)循環(huán)數(shù)高于一定的值（大于30）時(shí)，目的條帶強(qiáng)度差別不大，且較高的循環(huán)數(shù)更易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，綜合考慮，選擇30作為最終的循環(huán)數(shù)。

在運(yùn)用PCR方法檢測(cè)芝麻過(guò)敏原時(shí)，特異性和靈敏度是兩個(gè)最重要的指標(biāo)。PCR方法的特異性主要體現(xiàn)在引物與靶基因的專一結(jié)合，本試驗(yàn)所用的引物在普通PCR和Real－time PCR的特異性檢驗(yàn)中特異性均良好，不與其他常見(jiàn)食品發(fā)生交叉反應(yīng)，可用于芝麻過(guò)敏原的檢測(cè)。由于微小劑量的芝麻過(guò)敏原即可引起患者強(qiáng)烈的過(guò)敏反應(yīng)，因此過(guò)敏原的檢測(cè)需要有較高的靈敏度［9］。本試驗(yàn)建立的普通PCR和Real－time PCR的檢測(cè)限分別達(dá)到了0.10，0.01ng芝麻基因組DNA。較高的靈敏度使得檢測(cè)食品中可能含有的極低劑量的芝麻過(guò)敏原成為了可能。在實(shí)際商品的檢測(cè)中，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)簽相符，但是在一種未標(biāo)示含有芝麻成分的餅干類食品中，兩種PCR方法均檢測(cè)出其含有芝麻過(guò)敏原，與商品食品標(biāo)簽不符。因此，建立的兩種PCR方法均可在日常商品的檢測(cè)中有效應(yīng)用。

在實(shí)際的檢驗(yàn)工作中，可根據(jù)試驗(yàn)要求選擇不同的方法，如對(duì)靈敏度要求相對(duì)較低則可選用價(jià)格便宜，設(shè)備要求較低的普通PCR方法，而當(dāng)靈敏度要求較高時(shí)，建議使用成本相對(duì)較高的Real－time PCR方法。

1 Johansson S G，Bieber T，Dahl R，et al.Revised nomenclature for allergy for global use：report of the nomenclature review committee of the world allergy organization，October 2003［J］.J.Allergy Clin.Immunol，2004，113（5）：832～836.

2 Wesley B，Barbara K，Ballmer W.Food allergy［J］.Mol.Nutr.Food.Res.，2006，50（7）：595～603.

3 Dalal I，Binson I，Reifen R，et al.Food allergy is a matter of geography after all：sesame as a major cause of severe IgE－mediated food allergic reactions among infants and young children in Israel［J］.Allergy，2002：57（4）：362～365.

4 Kanny G，Hauteclocque D，Moneret－Vautrin C，et al.Sesame seed and sesame seed oil contain masked allergens of growing importance［J］.Allergy，1996，51（12）：952～957.

5 Krska R，Welzig E，Baumgartner S.Immunoanalytical detection of allergenic proteins in food［J］.Anal.Bioanal.Chem.，2004，378（1）：63～65.

6 Holzhauser T，Vieths S.Indirect competitive ELISA for determination of traces of peanut（Arachis hypogaea L.）protein in complex food matrices［J］.J.Agric.Food Chem.，1999，47（2）：603～611.

7 Stephan O，Vieths S.Development of a real－time PCR and a sandwich ELISA for detection of potentially allergenic trace amounts of peanut（Arachis hypogaea）in processed foods［J］.J.Agric.Food Chem.，2004，52（12）：3 754～3 760.

8 Kiening M，Niessner R，Drs E，et al.Sandwich immunoassays for the determination of peanut and hazelnut traces in foods［J］.J.Agric.Food Chem.，2005，53（9）：3 321～3 327.

9 王國(guó)政，徐彥淵.食品過(guò)敏原的安全管理［J］.食品科學(xué)，2007，28（4）：355～359.

10 Elide A Pastorello，Elena Varin，Laura Farioli，et al.The major allergen of sesame seeds（Sesamum indicum）is a 2Salbumin［J］.Journal of Chromatography B，2001，756（1～2）：85～93.

11 Kleber N，Maier S，Hinrichs J.Antigenic response of bovineβlactoglobulin influenced by ultra－h(huán)igh pressure treatment and temperature［J］.Innovative Food Science and Emerging Technologies，2007，8（1）：39～45.

12 Bugyi Z，Nagy J，T?r?k K，et al.Towards development of incurred materials for quality assurance purposes in the analysis of food allergens［J］.Analytica Chimica Acta.，2010，672（1）：25～29.

13 Arjon J van Hengel.Food allergen detection method sand the challenge to protect food－allergic consumers［J］.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2007，389（1）：111～118.

14 Chen Q，Wei S S，Deng Z R，et al.Optimization of DNA extraction from seeds of sorghum sudanense（piper）stapf［J］.Not.Bot.Hort.Agrobot.Cluj，2009，37（1）：256～260.

15 Moller E M，Bahnweg G，Sandermann H，et al.A simple and efficient protocol for isolation of high molecular weight DNA from filamentous fungi，fruit bodies，and infected plant tissues［J］.Nucleic Acids Research，1992，20（22）：6 115～6 116.

16 Lahiff S，Glennon M，Lyng J，et al.Real－time polymerase chain reaction detection of bovine dna in meat and bone meal samples［J］.Journal of Food Protein，2002，65（7）：1 158～1 165.

Establishment of PCR method for detecting sesame allergen

ZHANG Wen－ju XU Qing－jin DENG Zhi－ruiCHEN Qin

（School of Life Sciences，Shanghai University，Shanghai200444，China）

Sesame is an important food allergen；low－level doses can cause severe allergic reactions.In this paper，PCR primers were designed based on sesame allergy protein（2Salbumin）gene sequence，and conventional PCR and Real－time PCR were established and optimized.The lowest DNA content that can be detected for conventional PCR was 0.1ng and 0.01ng for real－time PCR，respectively.The specificity of the methods is good and can be widely used.

sesame；allergen；PCR；Real－time PCR；2Salbumin

10.3969/j.issn.1003－5788.2012.02.013

張文舉（1981－），男，上海大學(xué)講師，博士。E－mail：shu＿wenjuzhang＠yahoo.com.cn

陳沁

2011－12－16