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        芝麻過(guò)敏原PCR檢測(cè)方法

        2012-12-28 00:47:18張文舉許慶金鄧志瑞
        食品與機(jī)械 2012年2期
        關(guān)鍵詞:過(guò)敏原芝麻條帶

        張文舉 許慶金 鄧志瑞 陳 沁

        (上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200444)

        芝麻過(guò)敏原PCR檢測(cè)方法

        張文舉 許慶金 鄧志瑞 陳 沁

        (上海大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200444)

        芝麻是重要的食品過(guò)敏原之一,微小劑量即可引起嚴(yán)重的過(guò)敏反應(yīng)。針對(duì)芝麻過(guò)敏蛋白-2S白蛋白的基因序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物,建立并優(yōu)化芝麻過(guò)敏原檢測(cè)的普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Realtime PCR)方法。結(jié)果表明,兩種方法的最低檢測(cè)限分別為0.1,0.01ng DNA,該方法特異性良好,成本較低,具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

        芝麻;過(guò)敏原;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);2S白蛋白

        食物過(guò)敏(food allergy)是食物刺激有機(jī)體產(chǎn)生的變態(tài)反應(yīng),嚴(yán)重者可在幾分鐘內(nèi)引起多種器官出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng),甚至導(dǎo)致個(gè)體休克或死亡[1]。發(fā)達(dá)國(guó)家每年有超過(guò)3%的成年人,6%~8%的兒童受各種過(guò)敏性疾病的困擾[2]。芝麻是常見(jiàn)的食物過(guò)敏原之一[3,4]。芝麻中含有多種過(guò)敏蛋白,比較重要的是:缺少硫元素的2S白蛋白(Ses i 1),富含硫元素的2S白蛋白(Ses i 2),7S球蛋白(Ses i 3)[5,6],2種油質(zhì)蛋白(Ses i 4和Ses i 5)[7]以及2種11S球蛋白(Ses i 6 和 Ses i 7)[8]等。其中2S白蛋白是最主要的致敏成分[9]。

        芝麻過(guò)敏已引起世界各國(guó)的關(guān)注,日本、澳大利亞和西方國(guó)家要求含有芝麻成分的食品包裝上必須含有芝麻過(guò)敏標(biāo)示,以防止有芝麻過(guò)敏體質(zhì)的人群誤食[9],因此,快速有效地檢測(cè)食品中可能含有的芝麻成分是防止芝麻過(guò)敏的有效手段。目前主要檢測(cè)芝麻過(guò)敏原的方法有SDS-PAGE、HPLC和HPLC-MS等[10]。這些方法直接檢測(cè)過(guò)敏蛋白,但食品加工易導(dǎo)致蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的破壞,影響檢測(cè)準(zhǔn)確性;同時(shí)有研究[11,12]證實(shí)變性后的部分蛋白可與抗體結(jié)合引起假陽(yáng)性,此外,上述方法存在檢測(cè)周期較長(zhǎng),不穩(wěn)定性因素多,工作量大等缺點(diǎn)[13]。而食品中存在的基因組DNA更穩(wěn)定且不易受食品加工的影響,因此基于基因組DNA開發(fā)的PCR技術(shù)在食品檢測(cè)中的成功應(yīng)用在一定程度上可解決上述問(wèn)題。鑒于此,本試驗(yàn)針對(duì)芝麻中的主要過(guò)敏原-2S白蛋白的基因序列設(shè)計(jì)引物,建立了用于芝麻過(guò)敏原檢測(cè)的PCR方法。

        1 材料和方法

        1.1 材料與儀器

        1.1.1 材料與試劑

        芝麻、花生、黃豆、黑豆、紅豆、綠豆、白豆、豌豆、大麥、小麥、蕎麥、燕麥、大米、小米、紅米、玉米、榛子:均購(gòu)自上海某超市;

        dNTPs、Taq酶,10×反應(yīng)緩沖液(含 Mg2+)和熒光定量反應(yīng)混合液:天根生物科技(北京)有限責(zé)任公司;

        乙醇、三氯甲烷:分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;

        異丙醇:分析純,中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?;瘜W(xué)試劑公司;

        異戊醇:分析純,上?;瘜W(xué)試劑有限公司

        氯化鈉:99.9%,上海生工生物工程有限公司;

        瓊脂糖 VI:AB0045-100C,上海生工生物工程有限公司;

        十六烷基三甲基溴化胺(CTAB),十二烷基硫酸鈉(SDS):99.0%,上海生工生物工程有限公司;

        三(羥甲基)氨基甲烷(Tris):99.9%,上海生工生物工程有限公司;

        乙二胺四乙酸、乙酸:分析純,上海豪申化學(xué)試劑有限公司。

        1.1.2 主要儀器

        電泳儀:Tanon EPS 300A,上海天能科技有限公司;

        凝膠成像系統(tǒng):Tanon 3500,上海天能科技有限公司;

        電子天平:PB602-N,梅特勒-托利多集團(tuán);

        離心機(jī):Pico 17,德國(guó)賀利氏有限公司;

        聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀:S1000Thermal Cycler,伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司;

        實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀:ICycler Thermal Cycler(iQ5),伯樂(lè)實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司。

        1.2 試驗(yàn)方法

        引物由上海生工生物工程有限公司合成;TES溶液:Tris溶液(100mM,pH=8.0),EDTA 溶液(10mM),2%SDS溶液;SEVGA溶液(氯仿∶異戊醇=24∶1);其他試劑按常規(guī)方法配制。

        1.2.1 DNA的提取 芝麻DNA的提取方法參照Chen[14],Moller[15]等的方法并稍作修改:

        (1)液氮中研磨種子,取0.1g于1.5mL Eppendorf管中,加入500μL TES溶液和7μL Proteinase K溶液(0.01mg/μL)混勻,置于55℃水浴鍋中,水浴60~120min,期間混勻幾次;

        (2)取出水浴后的上述溶液,調(diào)節(jié)其鹽濃度至1.4M,加入1/10體積的CTAB溶液(10%),置于65℃水浴10min;

        (3)待水浴后,取出,加入等體積SEVGA溫和混勻,12 000r/min離心10min,取上清;

        (4)加入3μL RNase A于上清液中,37℃水浴30min;

        (5)取出水浴后的溶液,加入等體積-20℃預(yù)冷的異丙醇,-20℃放置40min以上,13 000r/min離心15min,棄上清;

        (6)向得到的沉淀中加入500μL 70%乙醇,懸浮洗滌后12 000r/min離心5min,去上清;

        (7)加入200μL 70%乙醇于得到的上述沉淀,去上清;

        (8)向得到的沉淀中加50μL雙蒸水溶解,測(cè)DNA濃度和純度,分裝,低溫(-20℃)保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.2.2 引物設(shè)計(jì) 針對(duì)芝麻2S白蛋白的基因序列(FJ222624.1),運(yùn)用軟件Primer Primier5.0設(shè)計(jì)引物Ses F/Ses R(表1),預(yù)計(jì)PCR擴(kuò)增的目的條帶大小為126bp,該引物可用于普通PCR和Real-time PCR檢測(cè)體系。

        1.2.3 PCR反應(yīng)體系和條件 普通PCR擴(kuò)增總體系20μL,含 2μL PCR buffer(Mg2+plus),3.2μL dNTPs(2.5mM),2μL DNA模板,2μL引物(each 3μM),0.4μL Taq酶(2.5U/mL),10.4μL雙蒸水;PCR反應(yīng)條件:94℃30s,54.6 ℃ 30s,72 ℃ 15s,30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后,在凝膠成像系統(tǒng)上分析結(jié)果。

        Real-timePCR擴(kuò)增體系如下:2μL DNA模板,2μL引物(1.5μM),9μL熒光定量反應(yīng)混合液,加雙蒸水至20μL;實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀反應(yīng)條件:94℃ 10s,54.6℃20s,72℃20s,40個(gè)循環(huán)。試驗(yàn)結(jié)果由實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀自帶軟件分析。

        表1 引物序列Table 1 Primer sequences

        2 結(jié)果與分析

        2.1 DNA濃度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響

        設(shè)定不同DNA濃度進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知,隨著DNA濃度的降低,目的條帶強(qiáng)度越來(lái)越弱;當(dāng)DNA用量為10ng時(shí),條帶亮度適中,清晰度較好;但小于10ng時(shí),目的條帶較弱。因此選定10ng作為后續(xù)試驗(yàn)DNA的用量。

        圖1 DNA含量對(duì)PCR擴(kuò)增的影響Figure 1 Effect of DNA concentrations on PCR amplification

        2.2 引物濃度、退火溫度及循環(huán)數(shù)對(duì)PCR擴(kuò)增的影響

        引物濃度、循環(huán)數(shù)及退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響見(jiàn)圖2。

        由圖2(a)可知,隨著引物濃度的降低,目的條帶的強(qiáng)度越來(lái)越弱,在0.25μM時(shí)目的條帶已經(jīng)相對(duì)較弱。為保證電泳結(jié)果的清晰度,選擇0.5μM作為后續(xù)試驗(yàn)的引物濃度。

        由圖2(b)可知,當(dāng)循環(huán)數(shù)為25時(shí),目的條帶強(qiáng)度較弱;而當(dāng)循環(huán)數(shù)為35時(shí),其目的條帶強(qiáng)度與循環(huán)數(shù)為30時(shí)相差不大。對(duì)于一般PCR擴(kuò)增而言,循環(huán)數(shù)較高時(shí)相對(duì)更容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,因此選擇循環(huán)數(shù)30開展后續(xù)的試驗(yàn)。

        由圖2(c)可知,當(dāng)退火溫度低于54.6℃時(shí),目的條帶強(qiáng)度相對(duì)較強(qiáng)。而對(duì)于一般PCR擴(kuò)增來(lái)說(shuō),相對(duì)較低的退火溫度更易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。為保證擴(kuò)增條帶的亮度和特異性,本試驗(yàn)選擇54.6℃作為后續(xù)試驗(yàn)的退火溫度。

        2.3 PCR擴(kuò)增的特異性及靈敏度檢驗(yàn)

        以芝麻基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照,選取其他16種常見(jiàn)的食品提取DNA并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖3(a)可知,只有以芝麻DNA為模板的PCR擴(kuò)增出現(xiàn)目的條帶,其他均未出現(xiàn)目的條帶,表明該引物具有良好的特異性。

        圖2 引物濃度、循環(huán)數(shù)及退火溫度對(duì)PCR擴(kuò)增的影響Figure 2 Effect of primer concentrations,cycles and annealing temperatures on PCR amplification

        圖3 PCR方法的特異性及靈敏度Figure 3 Specificity and sensitivity of PCR method

        在PCR擴(kuò)增體系中,對(duì)10ng DNA依次進(jìn)行10倍稀釋,再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由圖3(b)可知,隨著DNA用量的降低目的條帶越來(lái)越弱;大于0.1ng時(shí)均有明顯的目的條帶出現(xiàn);而小于0.1ng時(shí)則沒(méi)有清晰的目的條帶。因此,本試驗(yàn)建立的普通PCR方法的最低檢測(cè)限是0.1ng DNA。

        2.4 Real-time PCR擴(kuò)增體系的建立

        以芝麻基因組DNA作為陽(yáng)性對(duì)照,提取其他16種常見(jiàn)食品的DNA并進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。由圖4(a)可知,只有芝麻基因組DNA出現(xiàn)了熒光擴(kuò)增信號(hào),而其他未出現(xiàn)熒光信號(hào),表明該引物擴(kuò)增特異性良好,適合Real-time PCR方法檢測(cè)芝麻過(guò)敏原。

        使用10倍稀釋的芝麻 DNA(100,10,1,10-1,10-2,10-3,10-4ng)進(jìn)行 Real-time PCR擴(kuò)增并建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。由圖4(b)可知,在DNA含量大于0.01ng時(shí),擴(kuò)增結(jié)果具有較好的重復(fù)性,且不同濃度DNA的擴(kuò)增結(jié)果線性良好,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量關(guān)系式:

        式中:

        y——Ct值;

        x——DNA質(zhì)量的自然對(duì)數(shù)值。

        而當(dāng)DNA含量低于0.01ng時(shí),擴(kuò)增不能得到良好的重復(fù)性,而且不能與前述結(jié)果形成良好的線性。因此,該Real-time PCR體系的檢測(cè)限為0.01ng芝麻基因組DNA。

        2.5 實(shí)際商品檢驗(yàn)

        圖4 芝麻DNA Real-time PCR檢測(cè)體系的建立Figure 4 Establishment of the Real-time PCR method to detect sesame DNA

        在優(yōu)化條件后,以芝麻基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照,提取17種市售商品的DNA并進(jìn)行普通PCR和Real-time PCR擴(kuò)增。由表2可知,對(duì)于標(biāo)示中可能含有芝麻成分的3種餅干類食品(C1,C3,C4),普通 PCR和 Real-time PCR方法檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性,與標(biāo)示相符;而對(duì)于所有未標(biāo)示含有芝麻成分的巧克力類(C7~C12)和醬類食品(C13~C17)檢測(cè)結(jié)果均為陰性,亦與標(biāo)示相符。此外,在一種未標(biāo)示含有芝麻成分的餅干類食品(C5)中,兩種PCR方法的檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性,表明其含有芝麻過(guò)敏原成分,而標(biāo)簽中未表明這點(diǎn)。

        表2 實(shí)際商品中芝麻過(guò)敏原的檢測(cè)+Table 2 Detection of sesame allergen in commodities

        3 討論

        影響PCR擴(kuò)增的因素很多,本試驗(yàn)針對(duì)其中4個(gè)主要參數(shù)(模板DNA用量,引物濃度,循環(huán)數(shù)和退火溫度)進(jìn)行了優(yōu)化。只有適宜的模板DNA用量和引物濃度才能得到理想的擴(kuò)增條帶,而過(guò)低的模板量和引物濃度會(huì)使得擴(kuò)增效率低下;模板DNA過(guò)量時(shí)引物會(huì)過(guò)早耗盡,可能導(dǎo)致出現(xiàn)彌散狀背景[16];過(guò)高的引物濃度傾向于形成非特異性產(chǎn)物,同時(shí)形成大量引物二聚體。在本試驗(yàn)中,當(dāng)DNA用量為10ng,引物濃度為0.5μM時(shí)PCR擴(kuò)增條帶單一,亮度適中,可用于后續(xù)試驗(yàn)。退火溫度對(duì)于PCR擴(kuò)增的特異性和效率具有重要影響,試驗(yàn)結(jié)果表明在一定的溫度范圍內(nèi)(48~65℃),擴(kuò)增效果良好,而當(dāng)退火溫度低于54.6℃時(shí),目的條帶強(qiáng)度相對(duì)較強(qiáng),同時(shí)考慮到較低的退火溫度容易引起非特異性擴(kuò)增,為了保證目的條帶的亮度和PCR的特異性,選擇54.6℃作為最終的退火溫度。循環(huán)數(shù)對(duì)于PCR擴(kuò)增的影響較為明顯,本試驗(yàn)中,當(dāng)循環(huán)數(shù)高于一定的值(大于30)時(shí),目的條帶強(qiáng)度差別不大,且較高的循環(huán)數(shù)更易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,綜合考慮,選擇30作為最終的循環(huán)數(shù)。

        在運(yùn)用PCR方法檢測(cè)芝麻過(guò)敏原時(shí),特異性和靈敏度是兩個(gè)最重要的指標(biāo)。PCR方法的特異性主要體現(xiàn)在引物與靶基因的專一結(jié)合,本試驗(yàn)所用的引物在普通PCR和Real-time PCR的特異性檢驗(yàn)中特異性均良好,不與其他常見(jiàn)食品發(fā)生交叉反應(yīng),可用于芝麻過(guò)敏原的檢測(cè)。由于微小劑量的芝麻過(guò)敏原即可引起患者強(qiáng)烈的過(guò)敏反應(yīng),因此過(guò)敏原的檢測(cè)需要有較高的靈敏度[9]。本試驗(yàn)建立的普通PCR和Real-time PCR的檢測(cè)限分別達(dá)到了0.10,0.01ng芝麻基因組DNA。較高的靈敏度使得檢測(cè)食品中可能含有的極低劑量的芝麻過(guò)敏原成為了可能。在實(shí)際商品的檢測(cè)中,發(fā)現(xiàn)大多數(shù)的檢測(cè)結(jié)果與標(biāo)簽相符,但是在一種未標(biāo)示含有芝麻成分的餅干類食品中,兩種PCR方法均檢測(cè)出其含有芝麻過(guò)敏原,與商品食品標(biāo)簽不符。因此,建立的兩種PCR方法均可在日常商品的檢測(cè)中有效應(yīng)用。

        在實(shí)際的檢驗(yàn)工作中,可根據(jù)試驗(yàn)要求選擇不同的方法,如對(duì)靈敏度要求相對(duì)較低則可選用價(jià)格便宜,設(shè)備要求較低的普通PCR方法,而當(dāng)靈敏度要求較高時(shí),建議使用成本相對(duì)較高的Real-time PCR方法。

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        Establishment of PCR method for detecting sesame allergen

        ZHANG Wen-ju XU Qing-jin DENG Zhi-ruiCHEN Qin

        (School of Life Sciences,Shanghai University,Shanghai200444,China)

        Sesame is an important food allergen;low-level doses can cause severe allergic reactions.In this paper,PCR primers were designed based on sesame allergy protein(2Salbumin)gene sequence,and conventional PCR and Real-time PCR were established and optimized.The lowest DNA content that can be detected for conventional PCR was 0.1ng and 0.01ng for real-time PCR,respectively.The specificity of the methods is good and can be widely used.

        sesame;allergen;PCR;Real-time PCR;2Salbumin

        10.3969/j.issn.1003-5788.2012.02.013

        張文舉(1981-),男,上海大學(xué)講師,博士。E-mail:shu_wenjuzhang@yahoo.com.cn

        陳沁

        2011-12-16

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