張文舉 許慶金 鄧志瑞 陳 沁

（上海大學生命科學學院，上海 200444）

芝麻過敏原PCR檢測方法

張文舉 許慶金 鄧志瑞 陳 沁

（上海大學生命科學學院，上海 200444）

芝麻是重要的食品過敏原之一，微小劑量即可引起嚴重的過敏反應。針對芝麻過敏蛋白－2S白蛋白的基因序列設計PCR擴增引物，建立并優(yōu)化芝麻過敏原檢測的普通聚合酶鏈式反應（PCR）和實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Realtime PCR）方法。結果表明，兩種方法的最低檢測限分別為0.1，0.01ng DNA，該方法特異性良好，成本較低，具有一定的應用價值。

芝麻；過敏原；聚合酶鏈式反應；實時熒光定量聚合酶鏈式反應；2S白蛋白

食物過敏（food allergy）是食物刺激有機體產生的變態(tài)反應，嚴重者可在幾分鐘內引起多種器官出現過敏反應，甚至導致個體休克或死亡［1］。發(fā)達國家每年有超過3%的成年人，6%～8%的兒童受各種過敏性疾病的困擾［2］。芝麻是常見的食物過敏原之一［3，4］。芝麻中含有多種過敏蛋白，比較重要的是：缺少硫元素的2S白蛋白（Ses i 1），富含硫元素的2S白蛋白（Ses i 2），7S球蛋白（Ses i 3）［5，6］，2種油質蛋白（Ses i 4和Ses i 5）［7］以及2種11S球蛋白（Ses i 6 和 Ses i 7）［8］等。其中2S白蛋白是最主要的致敏成分［9］。

芝麻過敏已引起世界各國的關注，日本、澳大利亞和西方國家要求含有芝麻成分的食品包裝上必須含有芝麻過敏標示，以防止有芝麻過敏體質的人群誤食［9］，因此，快速有效地檢測食品中可能含有的芝麻成分是防止芝麻過敏的有效手段。目前主要檢測芝麻過敏原的方法有SDS－PAGE、HPLC和HPLC－MS等［10］。這些方法直接檢測過敏蛋白，但食品加工易導致蛋白質空間構象的破壞，影響檢測準確性；同時有研究［11，12］證實變性后的部分蛋白可與抗體結合引起假陽性，此外，上述方法存在檢測周期較長，不穩(wěn)定性因素多，工作量大等缺點［13］。而食品中存在的基因組DNA更穩(wěn)定且不易受食品加工的影響，因此基于基因組DNA開發(fā)的PCR技術在食品檢測中的成功應用在一定程度上可解決上述問題。鑒于此，本試驗針對芝麻中的主要過敏原－2S白蛋白的基因序列設計引物，建立了用于芝麻過敏原檢測的PCR方法。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

芝麻、花生、黃豆、黑豆、紅豆、綠豆、白豆、豌豆、大麥、小麥、蕎麥、燕麥、大米、小米、紅米、玉米、榛子：均購自上海某超市；

dNTPs、Taq酶，10×反應緩沖液（含 Mg2＋）和熒光定量反應混合液：天根生物科技（北京）有限責任公司；

乙醇、三氯甲烷：分析純，國藥集團化學試劑有限公司；

異丙醇：分析純，中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司；

異戊醇：分析純，上海化學試劑有限公司

氯化鈉：99.9%，上海生工生物工程有限公司；

瓊脂糖 VI：AB0045－100C，上海生工生物工程有限公司；

十六烷基三甲基溴化胺（CTAB），十二烷基硫酸鈉（SDS）：99.0%，上海生工生物工程有限公司；

三（羥甲基）氨基甲烷（Tris）：99.9%，上海生工生物工程有限公司；

乙二胺四乙酸、乙酸：分析純，上海豪申化學試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器

電泳儀：Tanon EPS 300A，上海天能科技有限公司；

凝膠成像系統：Tanon 3500，上海天能科技有限公司；

電子天平：PB602－N，梅特勒－托利多集團；

離心機：Pico 17，德國賀利氏有限公司；

聚合酶鏈式反應儀：S1000Thermal Cycler，伯樂實驗設備公司；

實時熒光定量聚合酶鏈式反應儀：ICycler Thermal Cycler（iQ5），伯樂實驗設備公司。

1.2 試驗方法

引物由上海生工生物工程有限公司合成；TES溶液：Tris溶液（100mM，pH＝8.0），EDTA 溶液（10mM），2%SDS溶液；SEVGA溶液（氯仿∶異戊醇＝24∶1）；其他試劑按常規(guī)方法配制。

1.2.1 DNA的提取 芝麻DNA的提取方法參照Chen［14］，Moller［15］等的方法并稍作修改：

（1）液氮中研磨種子，取0.1g于1.5mL Eppendorf管中，加入500μL TES溶液和7μL Proteinase K溶液（0.01mg/μL）混勻，置于55℃水浴鍋中，水浴60～120min，期間混勻幾次；

（2）取出水浴后的上述溶液，調節(jié)其鹽濃度至1.4M，加入1/10體積的CTAB溶液（10%），置于65℃水浴10min；

（3）待水浴后，取出，加入等體積SEVGA溫和混勻，12 000r/min離心10min，取上清；

（4）加入3μL RNase A于上清液中，37℃水浴30min；

（5）取出水浴后的溶液，加入等體積－20℃預冷的異丙醇，－20℃放置40min以上，13 000r/min離心15min，棄上清；

（6）向得到的沉淀中加入500μL 70%乙醇，懸浮洗滌后12 000r/min離心5min，去上清；

（7）加入200μL 70%乙醇于得到的上述沉淀，去上清；

（8）向得到的沉淀中加50μL雙蒸水溶解，測DNA濃度和純度，分裝，低溫（－20℃）保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計 針對芝麻2S白蛋白的基因序列（FJ222624.1），運用軟件Primer Primier5.0設計引物Ses F/Ses R（表1），預計PCR擴增的目的條帶大小為126bp，該引物可用于普通PCR和Real－time PCR檢測體系。

1.2.3 PCR反應體系和條件 普通PCR擴增總體系20μL，含 2μL PCR buffer（Mg2＋plus），3.2μL dNTPs（2.5mM），2μL DNA模板，2μL引物（each 3μM），0.4μL Taq酶（2.5U/mL），10.4μL雙蒸水；PCR反應條件：94℃30s，54.6 ℃ 30s，72 ℃ 15s，30個循環(huán)。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳后，在凝膠成像系統上分析結果。

Real－timePCR擴增體系如下：2μL DNA模板，2μL引物（1.5μM），9μL熒光定量反應混合液，加雙蒸水至20μL；實時熒光定量聚合酶鏈式反應儀反應條件：94℃ 10s，54.6℃20s，72℃20s，40個循環(huán)。試驗結果由實時熒光定量聚合酶鏈式反應儀自帶軟件分析。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2 結果與分析

2.1 DNA濃度對PCR擴增的影響

設定不同DNA濃度進行PCR擴增，結果見圖1。由圖1可知，隨著DNA濃度的降低，目的條帶強度越來越弱；當DNA用量為10ng時，條帶亮度適中，清晰度較好；但小于10ng時，目的條帶較弱。因此選定10ng作為后續(xù)試驗DNA的用量。

圖1 DNA含量對PCR擴增的影響Figure 1 Effect of DNA concentrations on PCR amplification

2.2 引物濃度、退火溫度及循環(huán)數對PCR擴增的影響

引物濃度、循環(huán)數及退火溫度對PCR擴增的影響見圖2。

由圖2（a）可知，隨著引物濃度的降低，目的條帶的強度越來越弱，在0.25μM時目的條帶已經相對較弱。為保證電泳結果的清晰度，選擇0.5μM作為后續(xù)試驗的引物濃度。

由圖2（b）可知，當循環(huán)數為25時，目的條帶強度較弱；而當循環(huán)數為35時，其目的條帶強度與循環(huán)數為30時相差不大。對于一般PCR擴增而言，循環(huán)數較高時相對更容易出現非特異性擴增，因此選擇循環(huán)數30開展后續(xù)的試驗。

由圖2（c）可知，當退火溫度低于54.6℃時，目的條帶強度相對較強。而對于一般PCR擴增來說，相對較低的退火溫度更易出現非特異性擴增。為保證擴增條帶的亮度和特異性，本試驗選擇54.6℃作為后續(xù)試驗的退火溫度。

2.3 PCR擴增的特異性及靈敏度檢驗

以芝麻基因組DNA為陽性對照，選取其他16種常見的食品提取DNA并進行PCR擴增。由圖3（a）可知，只有以芝麻DNA為模板的PCR擴增出現目的條帶，其他均未出現目的條帶，表明該引物具有良好的特異性。

圖2 引物濃度、循環(huán)數及退火溫度對PCR擴增的影響Figure 2 Effect of primer concentrations，cycles and annealing temperatures on PCR amplification

圖3 PCR方法的特異性及靈敏度Figure 3 Specificity and sensitivity of PCR method

在PCR擴增體系中，對10ng DNA依次進行10倍稀釋，再進行PCR擴增。由圖3（b）可知，隨著DNA用量的降低目的條帶越來越弱；大于0.1ng時均有明顯的目的條帶出現；而小于0.1ng時則沒有清晰的目的條帶。因此，本試驗建立的普通PCR方法的最低檢測限是0.1ng DNA。

2.4 Real－time PCR擴增體系的建立

以芝麻基因組DNA作為陽性對照，提取其他16種常見食品的DNA并進行Real－time PCR擴增。由圖4（a）可知，只有芝麻基因組DNA出現了熒光擴增信號，而其他未出現熒光信號，表明該引物擴增特異性良好，適合Real－time PCR方法檢測芝麻過敏原。

使用10倍稀釋的芝麻 DNA（100，10，1，10－1，10－2，10－3，10－4ng）進行 Real－time PCR擴增并建立標準曲線。由圖4（b）可知，在DNA含量大于0.01ng時，擴增結果具有較好的重復性，且不同濃度DNA的擴增結果線性良好，得到標準曲線的定量關系式：

式中：

y——Ct值；

x——DNA質量的自然對數值。

而當DNA含量低于0.01ng時，擴增不能得到良好的重復性，而且不能與前述結果形成良好的線性。因此，該Real－time PCR體系的檢測限為0.01ng芝麻基因組DNA。

2.5 實際商品檢驗

圖4 芝麻DNA Real－time PCR檢測體系的建立Figure 4 Establishment of the Real－time PCR method to detect sesame DNA

在優(yōu)化條件后，以芝麻基因組DNA為陽性對照，提取17種市售商品的DNA并進行普通PCR和Real－time PCR擴增。由表2可知，對于標示中可能含有芝麻成分的3種餅干類食品（C1，C3，C4），普通 PCR和 Real－time PCR方法檢測結果均為陽性，與標示相符；而對于所有未標示含有芝麻成分的巧克力類（C7～C12）和醬類食品（C13～C17）檢測結果均為陰性，亦與標示相符。此外，在一種未標示含有芝麻成分的餅干類食品（C5）中，兩種PCR方法的檢測結果均為陽性，表明其含有芝麻過敏原成分，而標簽中未表明這點。

表2 實際商品中芝麻過敏原的檢測+Table 2 Detection of sesame allergen in commodities

3 討論

影響PCR擴增的因素很多，本試驗針對其中4個主要參數（模板DNA用量，引物濃度，循環(huán)數和退火溫度）進行了優(yōu)化。只有適宜的模板DNA用量和引物濃度才能得到理想的擴增條帶，而過低的模板量和引物濃度會使得擴增效率低下；模板DNA過量時引物會過早耗盡，可能導致出現彌散狀背景［16］；過高的引物濃度傾向于形成非特異性產物，同時形成大量引物二聚體。在本試驗中，當DNA用量為10ng，引物濃度為0.5μM時PCR擴增條帶單一，亮度適中，可用于后續(xù)試驗。退火溫度對于PCR擴增的特異性和效率具有重要影響，試驗結果表明在一定的溫度范圍內（48～65℃），擴增效果良好，而當退火溫度低于54.6℃時，目的條帶強度相對較強，同時考慮到較低的退火溫度容易引起非特異性擴增，為了保證目的條帶的亮度和PCR的特異性，選擇54.6℃作為最終的退火溫度。循環(huán)數對于PCR擴增的影響較為明顯，本試驗中，當循環(huán)數高于一定的值（大于30）時，目的條帶強度差別不大，且較高的循環(huán)數更易出現非特異性擴增，綜合考慮，選擇30作為最終的循環(huán)數。

在運用PCR方法檢測芝麻過敏原時，特異性和靈敏度是兩個最重要的指標。PCR方法的特異性主要體現在引物與靶基因的專一結合，本試驗所用的引物在普通PCR和Real－time PCR的特異性檢驗中特異性均良好，不與其他常見食品發(fā)生交叉反應，可用于芝麻過敏原的檢測。由于微小劑量的芝麻過敏原即可引起患者強烈的過敏反應，因此過敏原的檢測需要有較高的靈敏度［9］。本試驗建立的普通PCR和Real－time PCR的檢測限分別達到了0.10，0.01ng芝麻基因組DNA。較高的靈敏度使得檢測食品中可能含有的極低劑量的芝麻過敏原成為了可能。在實際商品的檢測中，發(fā)現大多數的檢測結果與標簽相符，但是在一種未標示含有芝麻成分的餅干類食品中，兩種PCR方法均檢測出其含有芝麻過敏原，與商品食品標簽不符。因此，建立的兩種PCR方法均可在日常商品的檢測中有效應用。

在實際的檢驗工作中，可根據試驗要求選擇不同的方法，如對靈敏度要求相對較低則可選用價格便宜，設備要求較低的普通PCR方法，而當靈敏度要求較高時，建議使用成本相對較高的Real－time PCR方法。

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Establishment of PCR method for detecting sesame allergen

ZHANG Wen－ju XU Qing－jin DENG Zhi－ruiCHEN Qin

（School of Life Sciences，Shanghai University，Shanghai200444，China）

Sesame is an important food allergen；low－level doses can cause severe allergic reactions.In this paper，PCR primers were designed based on sesame allergy protein（2Salbumin）gene sequence，and conventional PCR and Real－time PCR were established and optimized.The lowest DNA content that can be detected for conventional PCR was 0.1ng and 0.01ng for real－time PCR，respectively.The specificity of the methods is good and can be widely used.

sesame；allergen；PCR；Real－time PCR；2Salbumin

10.3969/j.issn.1003－5788.2012.02.013

張文舉（1981－），男，上海大學講師，博士。E－mail：shu＿wenjuzhang＠yahoo.com.cn

陳沁

2011－12－16