范 亮張 彧陳歷俊姜鐵民

（1.大連工業(yè)大學(xué)，遼寧 大連 116034；2.北京三元食品股份有限公司，北京 100085）

雞胚蛋中水溶性維生素的測(cè)定及其孵化期間的變化

范 亮1，2張 彧1陳歷俊1姜鐵民2

（1.大連工業(yè)大學(xué)，遼寧 大連 116034；2.北京三元食品股份有限公司，北京 100085）

對(duì)雞胚蛋中水溶性維生素的色譜測(cè)定方法進(jìn)行優(yōu)化和驗(yàn)證，5種維生素的加標(biāo)回收率均在90%以上，且在0.1～50μg/mL具有良好的線性相關(guān)性；采用RP－HPLC對(duì)不同胚齡（即入孵的第0、2、4、6、8、10、12、14、16和18天）肉雞胚胎發(fā)育過程中的5種水溶性維生素（核黃素、煙酸、煙酰胺、吡哆醇和葉酸）進(jìn)行測(cè)定與分析，并與鮮蛋進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，隨著孵化時(shí)間的延長(zhǎng)，維生素B2、煙酸和葉酸3種維生素均有不同程度的增加，其中煙酸增加3.2倍，維生素B2增加31%；葉酸在12d達(dá)到最高，比鮮蛋約增加1倍；未能檢測(cè)出維生素B6和煙酰胺。

雞胚蛋；水溶性維生素；核黃素；煙酸；葉酸

雞胚蛋是受精雞蛋孵化至一定天數(shù)后，還未破殼，可食用的雞蛋，據(jù)《本草綱目》記載：“雞胚蛋有治療頭痛、偏頭痛、頭風(fēng)病及四肢瘋障之功能。”民間早有食用的習(xí)慣，俗稱“喜蛋”、“毛蛋”、“活珠子”等。而一個(gè)受精雞蛋能否正常發(fā)育，除了要求有正常的孵化條件外，在一定程度上還取決于孵化期間內(nèi)營(yíng)養(yǎng)成分的變化情況，因此弄清各種營(yíng)養(yǎng)的代謝變化規(guī)律，對(duì)調(diào)控禽類胚胎發(fā)育，提高孵化率有著重要的意義。

已有學(xué)者對(duì)雞胚蛋孵化期間的營(yíng)養(yǎng)變化情況進(jìn)行了研究：李利東等［1］研究發(fā)現(xiàn)雞胚蛋孵化期間多種對(duì)人體有益的營(yíng)養(yǎng)元素均有所增加，如牛磺酸增加了將近20倍，VE增加了100倍，鈣含量增加6倍多等，而對(duì)人體不利的脂肪含量下降50%，膽固醇下降5.5倍等，其研究結(jié)果與李國(guó)喜等的研究［2，3］基本一致；劉娟娟［4］比較了不同品種雞胚蛋孵化期間營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的變化規(guī)律情況，發(fā)現(xiàn)不同品種的雞胚蛋在孵化期間變化規(guī)律也略有不同，但總體趨勢(shì)相似；房興堂等［5］還對(duì)雞胚蛋的蛋白質(zhì)脂肪的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)移進(jìn)行了一定的研究，發(fā)現(xiàn)胚胎中的蛋白質(zhì)和脂肪主要來源于蛋黃。但目前還沒有對(duì)雞胚蛋中的一些重要的水溶性維生素進(jìn)行研究的報(bào)道，如參與體內(nèi)脂質(zhì)代謝，組織呼吸的氧化過程和糖類無氧過程的煙酸和煙酰胺；參與神經(jīng)遞質(zhì)、糖原、核酸以及所有氨基酸代謝的維生素B6以及對(duì)神經(jīng)細(xì)胞與腦發(fā)育有促進(jìn)作用的葉酸等。因此，本試驗(yàn)分別對(duì)不同胚齡雞胚蛋中的維生素B2，煙酸、煙酰胺、維生素B6以及葉酸進(jìn)行檢測(cè)分析，旨在為人們食用雞胚蛋提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也對(duì)雞胚蛋的深加工提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 樣品

樣品取自北京華都食品有限公司，分別取無精蛋、鮮蛋、0，2，4，6，8，10，12，14，16，18d胚齡雞蛋，去殼后用高速勻漿機(jī)混勻，并分裝于－20℃保存待測(cè)

1.2 主要試劑

鹽酸吡哆醇、葉酸、煙酸、煙酰胺和核黃素標(biāo)準(zhǔn)品：德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH公司；

三氟乙酸：色譜純，美國(guó)Tedia公司；

乙腈：色譜純，美國(guó)Fisher公司；

水：市售娃哈哈純凈水；

其余試劑均為分析純。

1.3 主要儀器

高效液相色譜儀：含LC－10ATVP二元泵，SPD10Avp紫外檢測(cè)器，classvp軟件，日本Shimadzu公司；

雙光束紫外可見光分光光度計(jì)：Cintra20，澳大利亞GBC公司；

冷凍離心機(jī)：2K15，美國(guó)Sigma公司；

C18色譜柱：Venusil XBP C18，天津博納杰艾爾科技有限公司。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.4.1 煙酸、煙酰胺、吡哆醇 分別取煙酸、煙酰胺和吡哆醇溶液50mg于50mL容量瓶中，用水溶解并定容至刻度［6］。

1.4.2 葉酸 稱取10mg葉酸，溶解于0.01mol/L氫氧化鈉乙醇溶液（乙醇∶水＝1∶4）并定容至100mL［7］。

1.4.3 核黃素 取50mg核黃素溶于0.02mol/L乙酸溶液中，并定容至500mL棕色容量瓶中［8］。

1.5 樣品提取

1.5.1 核黃素、煙酸、煙酰胺和吡哆醇 參照文獻(xiàn)［9］提取煙酸、煙酰胺和維生素B6，并稍加改動(dòng)，稱取樣品1～2g于150mL三角瓶中，加入0.1M鹽酸溶液，于121℃水解30min，冷卻后，以2.5M乙酸鈉調(diào)pH至4.5，轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中，并用水定容至刻度，用0.22μm過濾后待測(cè)。

1.5.2 葉酸 參照文獻(xiàn)［10］并稍加改動(dòng)，稱取1～2g樣品于150mL三角瓶中，加入0.026mol/L Tric－HCl緩沖溶液（pH 7.4）含有1% （m/V）抗壞血酸鈉20mL，121℃高壓水解20min，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，加入5%三氯乙酸5mL，用超純水定容至刻度，混勻于4℃6 000r/min離心20min，上清液經(jīng)過0.22μm濾膜過濾貯存于4℃待測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件優(yōu)化

采用等度洗脫，流動(dòng)相為三氟乙酸（TFA）水溶液（含1g/L庚烷磺酸鈉）和乙腈，選用反相C18色譜柱5μm（4.6mm×25cm），本試驗(yàn)研究了不同濃度（3%～40%）乙腈對(duì)樣品出峰時(shí)間的影響，發(fā)現(xiàn)高濃度乙腈能縮短出峰時(shí)間，但是會(huì)導(dǎo)致煙酸和煙酰胺無法分離，較低濃度乙腈會(huì)延長(zhǎng)保留時(shí)間。由圖1可知，當(dāng)乙腈濃度為10%時(shí)，可較好的分離核黃素、煙酸、煙酰胺和吡哆醇。由圖2可知，當(dāng)乙腈濃度為15%時(shí)，葉酸在25min內(nèi)可出峰，且樣品分離效果良好，故將檢測(cè)葉酸的最適乙腈濃度定為15%。此外，流動(dòng)相的pH 對(duì)分離水溶性維生素也至關(guān)重要［11］，Ciul.M 等［12］采用0.025%TFA水溶液和乙腈梯度洗脫檢測(cè)蜂蜜中的水溶性維生素，得到了較好的結(jié)果。本試驗(yàn)研究了不同濃度的TFA（0.025%～0.1%）對(duì)維生素分離的影響，結(jié)果表明在較低濃度TFA下葉酸和維生素B2均有拖尾現(xiàn)象，在濃度升至0.1%時(shí)，能較好的解決拖尾問題，且分離效果良好。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)混合液及雞胚蛋提取液色譜圖Figure 1 Chromatograms of a standard mixture of nicotinamide，nicotinic acid，riboflavin，pyridoxin and embryoed eggs

在190～500nm下對(duì)5種維生素進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，其最大吸收波長(zhǎng)分別為核黃素260nm、鹽酸吡哆醇290nm、煙酸和煙酰胺260nm、葉酸255nm，為方便試驗(yàn)，將鹽酸吡哆醇的吸光值設(shè)為290nm，其余均為260nm，該結(jié)果也與田穎等的研究［13］一致，柱溫采用 25 ℃［12，14，15］。

由圖1還可知，4種水溶性維生素的保留時(shí)間分別為煙酰胺tR＝15.3min、煙酸t(yī)R＝18.2min、核黃素tR＝38.1min和吡哆醇tR＝38.4min，但是在樣品中沒有發(fā)現(xiàn)煙酰胺和吡哆醇，在食物營(yíng)養(yǎng)成分表中也未查到雞蛋中煙酰胺和吡哆醇含量，這也與本試驗(yàn)的研究結(jié)果一致。由圖2還可知，葉酸的保留時(shí)間為tR＝21.4min。

2.2 方法驗(yàn)證

2.2.1 檢出限 進(jìn)空白樣品，以基線3倍噪聲值在標(biāo)準(zhǔn)曲線差得結(jié)果計(jì)算，測(cè)得5種維生素的檢出限分別為核黃素0.12μg/mL、煙酸0.075μg/mL、煙酰胺0.06μg/mL、吡哆醇0.045μg/mL、葉酸0.09μg/mL（表1），而 Lebiedzinska等［14］所得各種維生素的檢測(cè)限在0.19～9.2ng/mL，與本試驗(yàn)結(jié)果有較大出入，可能是儀器的不同而造成的。

2.2.2 線性范圍 將逐級(jí)稀釋的維生素混合標(biāo)準(zhǔn)工作液分別進(jìn)樣10μL，測(cè)得結(jié)果以峰面積為Y對(duì)質(zhì)量濃度x（μg/mL）作圖，結(jié)果見表1。由表1可知，各種維生素在0.1～50μg/mL線性關(guān)系良好。

圖2 葉酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液和雞胚蛋提取液色譜圖Figure 2 Chromatograms of a standard solution and embryoed eggs

表1 方法驗(yàn)證Table 1 Validation data

2.2.3 精密度和回收率 在上述試驗(yàn)條件下，取混合標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液5.0μg/mL，進(jìn)樣量10μL，平行測(cè)定5次，計(jì)算其變異系數(shù)，同時(shí)取已知濃度的樣品，分別加入樣品濃度的50%，100%，150%的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.5的方法制備后進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果（見表1）5種維生素的變異系數(shù)在3.34～6.18（n＝5），回收率均在90%以上，Ciulu等［12］研究表明各種維生素的回收率在90%～110%，變異系數(shù)在2.6～7.6，也與本試驗(yàn)結(jié)果基本一致。

2.3 不同胚齡雞胚蛋中水溶性維生素的含量

通過與水溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)混合液的保留時(shí)間的對(duì)比并向樣品提取溶液中加入已知濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液來確定樣品中含有相應(yīng)的維生素。之后對(duì)混標(biāo)進(jìn)行分析，待各個(gè)樣品完全分離后再分別對(duì)單個(gè)樣品進(jìn)行分析以確定各個(gè)物質(zhì)的出峰時(shí)間，外標(biāo)法定量。在線性范圍內(nèi)選取5個(gè)不同的濃度制作各個(gè)維生素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見表2。

表2 不同孵化期間雞胚蛋水溶性維生素含量變化+Table 2 Average concentration of water－soluble vitamins of different period embroyed eggs origin /（mg·kg－1）

由表2可知，雞胚蛋中維生素含量有所差別，其中以煙酸最多、葉酸次之、維生素B2最少，煙酰胺和維生素B6含量低于檢測(cè)限。

如果雞胚蛋中缺乏核黃素，在孵化至10～14d時(shí)會(huì)發(fā)生雞胚死亡。在孵化過程中所檢測(cè)的維生素B2的含量增加了31.2%，這與劉娟娟的研究結(jié)果［4］略有出入，她所檢測(cè)的4個(gè)品種的雞胚蛋在孵化過程中維生素B2含量均略有降低，但是變化不顯著，這可能與維生素B2主要以黃素蛋白的輔酶形式參與生理生化代謝有關(guān)［16］，自身含量損失不大。

煙酸含量增加3.7倍，且在0～12d煙酸含量增加緩慢，在12d后迅速增加，一方面這與雞胚蛋在孵化12d后胎兒開始大量吞食蛋白羊水導(dǎo)致水分急劇下降有關(guān)［1，4］，因未發(fā)現(xiàn)煙酰胺，故煙酸的增加含量并非是煙酰胺轉(zhuǎn)化而來，而在動(dòng)物體內(nèi)，色氨酸可以轉(zhuǎn)化為煙酸，且轉(zhuǎn)化率與肝臟中的色氨酸加氧酶有很大關(guān)系。研究［17］表明，雞胚在12d時(shí)肝臟生長(zhǎng)速度開始加快，有可能在肝臟增重的過程中增加了色氨酸加氧酶的分泌從而促進(jìn)了色氨酸－煙酸的轉(zhuǎn)化。

在孵化過程中，葉酸的含量呈現(xiàn)“先增加后減小”的趨勢(shì)，且在第12天含量達(dá)到最大，比鮮蛋約增加一倍，因?yàn)槿~酸無法在體內(nèi)合成和轉(zhuǎn)化，所以可能的原因是在整個(gè)孵化過程中胚蛋內(nèi)水分含量大大降低，從而導(dǎo)致干物質(zhì)含量上升［1，4］，而隨著孵化的進(jìn)行，至10～11d時(shí)，胚胎的心臟、肝臟和大腦等器官生長(zhǎng)速度開始加快，并于16d時(shí)達(dá)到生長(zhǎng)高峰期［17］，在此過程中雞胚DNA的合成，神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育以及氨基酸的代謝均發(fā)生了很大變化，而這些生理反應(yīng)變化均依賴葉酸的參與進(jìn)行，因此在12d后，葉酸的含量一直處于逐漸降低。從另一方面講，如果從補(bǔ)充葉酸含量來考慮，應(yīng)該選取12d之前的雞胚蛋。

3 結(jié)論

各種維生素在0.1～50μg/mL均有良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限分別為核黃素0.12μg/mL，煙酸0.075μg/mL，煙酰胺0.06μg/mL，吡哆醇0.045μg/mL，葉酸0.09μg/mL，變異系數(shù)在3.34～6.18且回收率均在90%以上。該方法同樣也可用來分析蛋制品的水溶性維生素含量。檢測(cè)了不同孵化期間雞胚蛋中水溶性維生素的含量變化情況，在孵化過程中核黃素、煙酸和葉酸的含量均有不同程度的增加，其中煙酸含量增加最多，約增加3.2倍，核黃素增加不明顯，而葉酸在12d時(shí)達(dá)到最大，并在12d后逐漸降低，整個(gè)孵化過程中均未發(fā)現(xiàn)煙酰胺和吡哆醇。

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Detection of water－solution vitamins in embroynated eggs and its changes during incubate

FAN Liang1，2ZHANG Yu1CHEN Li－jun1JIANG Tie－min2

（1.Dalian Polytechnology University，Dalian，Liaoning116034，China；2.Beijing Sanyuan Co.，Ltd，Beijing100085，China）

The assessment and validation of reliable and analytical method for the determination of water－solution vitamins，The recovery of the five kinds of vitamins are more than 90%and it appears a very good linearity during 0.1～50μg/mL。A RP－HPLC method was put to use to detect five water－soluble vitamins（riboflavin，、niacin、niacinamide、pyridoxin folic acid）in different incubate period（the 0th，2th，4th，6th，8th，10th，12th，14th，16thand 18thday after incubate）embroynated eggs and made a comparison with the fresh egg，the results indicated that as the incubate goes on，the content of riboflavin、niacin and folic acid had made a increase at different level，the content of niacin in the 18thday of embroynated eggs is 3.2times than fresh eggs，as to riboflavin，this amount is 31%，the biggest content of folic acid appears the 12thday，it is the twice amount of the fresh eggs，both of the pyridoxin and niacinamide were below the limit of detection.

embroynated eggs；water－solution vitamin；riboflavin；niacin；folic acid

10.3969/j.issn.1003－5788.2012.02.010

國(guó)家“863”計(jì)劃（編號(hào)：2011AA100903）；北京市科技計(jì)劃（編號(hào)：D10110504600000）

范亮（1985－），男，大連工業(yè)大學(xué)在讀碩士研究生。E－mail：fanliang24233＠163.com

陳歷俊

2011－12－01