葛慧華，林錦霞，張光亞

（華僑大學 化工學院，福建 廈門 361021）

以響應面法優(yōu)化短小芽孢桿菌木聚糖酶產酶條件

葛慧華，林錦霞，張光亞

（華僑大學 化工學院，福建 廈門 361021）

應用響應面分析對短小芽孢桿菌木聚糖酶的產酶條件進行優(yōu)化，得到碳源、氮源及培養(yǎng)時間3種因素交互影響的回歸方程.從該方程得到理論最佳產酶條件：培養(yǎng)時間為24h，麩皮、玉米粉、蛋白胨和NH4Cl的質量濃度分別為10，5，5，10g·L－1.在優(yōu)化條件下，實際最高產酶量為12.1mkat·L－1，與理論最高產酶量12.0mkat·L－1接近，比初始酶活提高12.2倍.

木聚糖酶；短小芽孢桿菌；響應面分析；交互影響

木聚糖酶（EC 3.2.1.8）是木聚糖降解酶系中的關鍵酶，在造紙、食品、飼料、紡織、釀酒、醫(yī)藥、環(huán)境和能源等行業(yè)有廣泛應用［1-2］.利用微生物發(fā)酵產生木聚糖酶，影響產量的因素除菌種本身以外，還和培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件密切相關.如何快速、有效找出主效應，確定最佳培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件是關鍵.響應面分析法是通過對響應面等值線的分析尋求最優(yōu)工藝參數，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間函數關系的一種統計方法 .應用響應面法得到的兩兩因素交互響應面圖直觀地反映因素間的交互影響，便于實驗者快速對實驗數據進行分析，提取有效信息［3］.已有報道利用該方法優(yōu)化木聚糖酶培養(yǎng)基并取得了較好的效果［4］，但缺乏對兩兩因素間交互影響的分析.本文在單因素考察的基礎上，選取影響較大的碳源和氮源作為復合考察的兩個因素，以培養(yǎng)時間為第3個因素，經響應面分析法對短小芽孢桿菌木聚糖酶的產酶條件進行優(yōu)化.

1 材料與方法

1.1 菌種

短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus），購于中國普通微生物菌種保藏管理中心，菌液加15%已滅菌的甘油，于－70℃冰箱保存.

1.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

基礎產酶培養(yǎng)基組成（g·L－1）：麩皮5.0，蛋白胨5.0，NaCl 1.0，K2HPO41.0，MgSO40.2，CaCl20.1.培養(yǎng)基滅菌之前用1mol·L－1NaOH調節(jié)pH值至9.5.接種之前，保存在－70℃冰箱的菌體先在LB（Luria－Bertani）培養(yǎng)基活化約4個h，待光密度D（620）為0.46左右，以1%的接種量接種至不同組成的產酶培養(yǎng)基.在50mL搖瓶中裝液5mL，于37℃，250r·min－1按要求培養(yǎng).

1.3 木聚糖酶的提取和檢測

將培養(yǎng)液于4℃，15 000r·min－1下離心10min，取上清液，細胞沉淀用9g·L－1的NaCl洗2次，250g·L－1蔗糖液（加終濃度為1mmol·L－1EDTA）洗1次.粗酶液為第1次離心的上清液和3次洗液，稀釋一定倍數后使用.取0.2mL酶液（用一定pH值的緩沖液稀釋一定的倍數），加入到0.2mL用pH＝7.0，0.05mol·L－1的磷酸鹽緩沖液（PBS）中配成的1%木聚糖溶液，于50℃下反應10min，加入0.4mL的DNS試劑，煮沸5min；用水定容至2.4mL后，在540nm波長下測光密度值［5］，以木糖制作標準曲線 .定義每秒鐘轉化1摩爾底物（被反應物）所需的酶活力為1個酶活力單位（kat）.空白對照以0.2mL，pH＝7.0的磷酸鹽緩沖液（PBS）代替粗酶液，其他的步驟同上.

1.4 復合因素考察產酶條件

為了優(yōu)化Bacillus pumilus木聚糖酶的最佳產酶條件，根據單因素單水平實驗，發(fā)現碳源和氮源是Bacillus pumilus木聚糖酶生產的主要影響因素.由于該生產菌是芽孢桿菌類，培養(yǎng)時間不同，菌體的生長水平相差較大，產酶水平也受限制.基于此，選取碳源（麩皮與玉米粉的質量比）和氮源（蛋白胨與NH4Cl的質量比）作為復合考察的兩個因素，培養(yǎng)時間（t）為第3個因素，安排3因素3水平實驗，如表1所示 .統計分析用STATISTICA 軟件（30d試用版）［6］.

表1 3因素3水平設計表Tab.1 Factorial design of the 3factors and 3levels

2 結果與分析

2.1 初始培養(yǎng)條件的優(yōu)化

依據表1的設計進行實驗，計算結果如表2所示.表2中：z為木聚糖酶酶活力 .由表2可知，最高的木聚糖酶活力出現在第3組（z＝8.7mkat·L－1），比第11組（除培養(yǎng)時間外，其他培養(yǎng)條件相同）酶活力高出3.64倍.

表2 初始培養(yǎng)條件的優(yōu)化實驗結果Tab.2 Optimal results of the primary culture condition

表3 實驗系數的估計值Tab.3 Coefficient estimates by the regression model

應用響應面法進行回歸分析，其t檢驗值和P檢驗值如表3所示.系數的可信程度與t檢驗值成正比，與P檢驗值成反比.即t檢驗值越大及P檢驗值越小，回歸系數的可信程度越高.當試驗在置信區(qū)間為99%和95%時，除X2，X21，X1X2，X2X3的系數外，其他系數均具有統計學意義.這些系數表明，其代表的因素可能為回歸模型的限制因子，改變這些因素值對木聚糖酶的生產有重要影響.

對實驗數據進行回歸響應分析，得到可以解釋各主因素對木聚糖酶生產的影響的二次模型為

式中：Y 為木聚糖酶的活力（mkat·L－1）；R＝0.979，P＜0.01.

整個模型的平方和（SS）結果表明：實驗的R2值為95.78%，即只有4.22%的的變數不能由模型解釋.該模型的F檢驗值為12.609，說明模型可信度較高.

2.2 木聚糖酶生產影響因素的響應面分析

應用響應面分析培養(yǎng)時間（X1）、麩皮與玉米粉的質量比（X2）及蛋白胨與NH4Cl的質量比（X3）對木聚糖酶生產的影響，3個因素兩兩相互作用的三維響應面如圖1所示.

由表3可知，短小芽孢桿菌木聚糖酶的生產與培養(yǎng)時間的長短有很大關系（X1系數的P檢驗值小于0.01），其他與木聚糖酶生產有關的因素有碳源的二次因子（X22的系數，P檢驗值小于0.05）.如圖1（a）所示，當麩皮與玉米粉的質量比為5∶10或是10∶5時，木聚糖酶的產量都呈相似的上升趨勢，并且培養(yǎng)時間越短，酶產量越高.

一般而言，短小芽孢桿菌木聚糖酶的產酶培養(yǎng)時間需要16h左右，與其半對數生長期相對應.產酶培養(yǎng)時間超過20h后，芽孢快速生長，使細胞裂解；當細胞開始裂解時，蛋白激酶分泌到培養(yǎng)基中，使酶發(fā)生水解.本次優(yōu)化實驗培養(yǎng)時間為24h，比48h或72h的酶產量都要高，說明培養(yǎng)時間在短小芽孢桿菌木聚糖酶的生產中起重要作用.

圖1 各因素與木聚糖酶產生的交互影響Fig.1 Interaction effect among the three factors responsible for xylanase production

由表3可知，蛋白胨與NH4Cl質量比的一次效應（P檢驗值小于0.01）和二次效應（P檢驗值小于0.05）都具有統計學重要意義.由圖1（b）可知，培養(yǎng)時間和蛋白胨與NH4Cl比例的交互影響，同樣對短小芽孢桿菌木聚糖酶的生產有重要影響.培養(yǎng)時間越短，蛋白胨與NH4Cl比例越大，產酶量越高.

由圖1（c）可知，當麩皮與玉米粉的質量比及蛋白胨與NH4Cl的質量比分別為5∶5和2∶5時，不考慮培養(yǎng)時間，木聚糖酶的產酶量最低.然而，當培養(yǎng)基組成取值在圖中直徑最大的圓形區(qū)域以外的配比時，木聚糖酶產酶量最大.

2.3 與其他木聚糖酶產生菌產酶條件優(yōu)化的比較

與其他細菌或真菌產木聚糖酶條件優(yōu)化比較，本優(yōu)化采用價格低廉的麩皮和玉米粉為復合碳源，未采用價格昂貴的木聚糖為單一碳源，約可使木聚糖酶整個生產過程的成本約降低25%［7］.優(yōu)化的最佳產酶培養(yǎng)時間僅為24h，與其他長達11d的產木聚糖酶培養(yǎng)比較，極大縮短了產酶時間.據報道［8］，利用響應面法和中心組合設計優(yōu)化Aspergillus fischeri產木聚糖酶，培養(yǎng)72h后，產酶量僅提高了1.9倍；而以纖維素大豆殘渣為碳源，應用3因素2水平中心組合設計實驗優(yōu)化Bacillus circulans產木聚糖酶，培養(yǎng)120h后，產酶量提高了2.5倍［7］.另一以木聚糖為碳源的3因素3水平實驗設計優(yōu)化Bacillus circulans D1產木聚糖酶，經48h培養(yǎng)后，木聚糖酶產量也僅提高了3.15倍［9］.文獻［10］應用響應面法優(yōu)化嗜鹽細菌產胞外木聚糖酶，經7d培養(yǎng)，產酶量提高了20多倍，但其使用價格昂貴的樺木木聚糖為底物，成本明顯高.

對于上述回歸出來的二次多項式方程進行求導求極值，在培養(yǎng)時間為24h，麩皮與玉米粉的質量濃度分別為10，5g·L－1，蛋白胨與NH4Cl的質量濃度分別為5，10g·L－1時，得到理論上最大木聚糖酶活力為12.0mkat·L－1.為了驗證此培養(yǎng)基成份和培養(yǎng)時間，重復實驗5次，得到木聚糖酶活力平均值為12.1mkat·L－1，比基礎培養(yǎng)基產木聚糖酶的活力提高了12.2倍.

3 結束語

以價格低廉的麩皮和玉米粉為復合碳源，以蛋白胨和NH4Cl為復合氮源，對短小芽孢桿菌木聚糖酶產酶條件進行優(yōu)化，應用響應面法對實驗結果進行分析，回歸出二次多項式回歸模型.對模型進行分析，得到理論產酶極大值.將從模型導出的最高酶活力的培養(yǎng)基組成進行反復實驗，得到的實驗值與理論值匹配良好，單位體積發(fā)酵液中木聚糖酶活力提高了12.2倍.

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Optimization of the Fermentation Conditions of Xylanase Production from Bacillus pumilus with Response Surface Analysis

GE Hui－h(huán)ua，LIN Jin－xia，ZHANG Guang－ya
（College of Chemical Engineering，Huaqiao University，Xiamen 361021，China）

The response surface analysis was applied to optimize the fermentation conditions of xylanase production from Bacillus pumilus.It resulted in a regression equation which reflected the interaction effect among carbon resource，nitrogen resource and cultivation time.The optimized fermentation conditions of xylanase production were：cultivation time 24 h，the proportion of bran and corn power 10∶5，the proportion of peptone and NH4Cl 5∶10.In this optimal conditions，the level of xylanase production was 12.1mkat·L－1，with an increase of 12.2－fold compared with the enzyme production in the basic medium.The experimental value was very close to the theoretic value，which was 12.0mkat·L－1according to the regression equation.

xylanase；Bacillus pumilus；response surface analysis；interaction

黃曉楠 英文審校：劉源崗）

TQ 925

A

1000－5013（2012）02－0172－04

2011－10－07

張光亞（1975－），男，副教授，主要從事酶與生物信息的研究.E－mail：zhgyghh＠hqu.edu.cn.

福建省自然科學基金資助項目（2009J01030）；華僑大學科研基金資助項目（07HZR20）