熊 鳴，趙曉航，朱智明，解 鵬，喬媛媛，安懷杰，曲 佳，何立東

長航對人體外周血細胞因子表達水平的影響

熊 鳴，趙曉航，朱智明，解 鵬，喬媛媛，安懷杰，曲 佳，何立東

目的 探討執(zhí)行海上編隊長航任務對艦員外周血細胞因子表達水平的影響。方法 采用多抗體芯片化學發(fā)光法定量比較海上任務人員(實驗組)和岸基人員(對照組)外周血120種細胞因子的表達差異。結(jié)果 與岸基人員相比，執(zhí)行海上長航任務艦員外周血34．17%(41/120)人體細胞因子表達水平改變，其中13種細胞因子表達升高，涉及Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化因子、有絲分裂原活化蛋白激酶等細胞信號通路，參與細胞趨化、免疫調(diào)節(jié)(尤其是細胞免疫調(diào)節(jié))、炎癥反應和細胞凋亡等重要生物學過程。結(jié)論執(zhí)行海上編隊長航任務124 d，部分艦員外周血多種細胞因子表達水平改變，提示海上綜合作業(yè)環(huán)境在一定程度上影響長遠航任務人員機體免疫功能。

細胞因子;抗體芯片;免疫調(diào)節(jié);長航

細胞因子(cytokine，CK)是指由活化免疫細胞或非免疫細胞合成分泌的能調(diào)節(jié)細胞生理功能、介導炎癥反應、參與免疫應答和組織修復等多種生物學效應的小分子多肽，是除免疫球蛋白和補體之外的又一類分泌型免疫分子［1］。細胞因子檢測是判斷機體免疫功能的一個重要指標。已有文獻報道，由于長航特殊的作業(yè)環(huán)境，艦員經(jīng)常遭遇生理和心理上的雙重障礙，主要表現(xiàn)在免疫功能失衡、血液組分和代謝改變、內(nèi)分泌調(diào)節(jié)紊亂、精神抑郁等［2-3］。因此，采用抗體芯片技術(shù)高通量地觀察艦員在海上長航綜合因素作用下，外周血細胞因子廣譜改變，有助于從分子水平認識長航對機體尤其對免疫功能的影響，為長航衛(wèi)勤保障提供理論依據(jù)［4-6］。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 一次性真空采血管和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA蛋白定量試劑盒購自BioRad公司;人細胞因子抗體芯片(Human cytokine antibody array C series 1000)試劑盒為美國Ray-Biotech公司產(chǎn)品;低速冷凍離心機為美國Thermo公司產(chǎn)品;掃描儀Uniscan D1000為清華紫光股份有限公司產(chǎn)品;芯片數(shù)據(jù)提取軟件Imagene 6.0為BioDiscovery公司產(chǎn)品。

1.2 實驗對象與分組 ①實驗組:執(zhí)行海上任務艦

員20名，連續(xù)海上航行124 d，年齡(21.25±1.13)歲，均為男性。根據(jù)人員訓練背景和執(zhí)行任務不同，分為實驗1組和實驗2組，每組各10名。于返航靠岸后次日清晨，空腹于肘正中靜脈采集促凝血2 ml，常規(guī)分離血清后，迅速低溫下分裝，于－80℃保存。②對照組:以岸基部隊人員作為對照組，共12名，年齡(21.33±1.27)歲，均為健康男性。采血時間和處理方式同實驗組。

1.3 待測血清樣本準備 分別等量混合來自實驗1組、2組各10名艦員和對照組12名岸基人員血清樣本，形成實驗組和對照組血清混合樣本池。BCA法蛋白定量后，1×封閉緩沖液稀釋，使其蛋白濃度在 50 ～500 μg/ml。

1.4 抗體芯片檢測細胞因子 采用人細胞因子抗體芯片 RayBio?Human Cytokine Antibody Array C Series 1000，通過化學發(fā)光法同時定量檢測上述3組混合樣本中120個細胞因子的蛋白表達水平。實驗過程簡述如下:每組血清樣本同時與2張硝酸纖維素膜雜交，每張膜上含有60種不同抗體，每種抗體均設(shè)有2個重復對照，其中包含陽性對照、陰性對照和空白對照。芯片經(jīng)封閉后，分別與等量的3組混合血清樣本共孵育，洗膜，依次與生物素標記的針對不同蛋白的特異性抗體和偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的抗鏈霉生物素抗體進行雜交反應，然后經(jīng)增強型化學發(fā)光(electro chemi luminescence，ECL)試劑顯影、X-線曝光等過程，獲得雜交后的斑點圖，掃描圖像并保存為灰度標簽圖像文件格式(tagged image file format，TIFF)圖片。

1.5 數(shù)據(jù)提取和轉(zhuǎn)換 各細胞因子的蛋白表達水平以雜交后對應斑點的平均灰度值表示。運行Imagene 6.0軟件，將該圖片中的點陣轉(zhuǎn)化為數(shù)字型數(shù)據(jù)，作為原始數(shù)據(jù)并儲存。以空白對照對應的平均灰度值作為本底，原始數(shù)據(jù)扣除本底后，通過陽性對照進行標準化處理，計算實驗組與對照組中對應細胞因子的標準化數(shù)據(jù)比值，即代表兩者的差異表達倍數(shù)。將差異表達倍數(shù)＞1．3或＜0．77的細胞因子定義為差異蛋白。

1.6 差異蛋白的功能分析 通過基因注釋(gene ontology，GO)數(shù)據(jù)庫明確差異蛋白的分子功能及主要參與的生物學過程，通過京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and enomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫定位差異蛋白所在的主要代謝通路，并分別歸類。

2 結(jié)果

2.1 長航引起人體血清細胞因子的表達改變 來自3組多個個體的混合血清樣本分別與含有120個人類細胞因子的抗體芯片雜交。結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組血清細胞因子的表達發(fā)生了明顯改變，差異表達＞1.3或＜0.77倍的細胞因子共有41個(34.17%，47/120)。其中，以干擾素誘導的T細胞α趨化因子(interferon-inducible T cell alpha chemoattractant，I-TAC)和生長調(diào)節(jié)癌基因-α(growth related oncogene-alpha，GRO-α)變化最為顯著，其蛋白表達水平分別上調(diào)或下調(diào)了2.16倍和0.44倍。在41個差異細胞因子中，實驗1組中有32個(26.67%，32/120)差異細胞因子，17個表達上調(diào)、15個表達下調(diào);實驗2組中有26個(21.67%，26/120)差異細胞因子，均呈表達上調(diào)(表1)。兩組中共有17個(14.17%，17/120)相同的差異細胞因子，其中，除4個細胞因子在兩組中表達改變不一致外，其余13個細胞因子均呈一致性表達升高(表2，圖1)。

表1 實驗1、2組細胞因子數(shù)量

表2 一致性差異表達細胞因子列表

圖1 抗體芯片顯示一致性差異表達細胞因子

2.2 差異細胞因子的功能分析 分別檢索GO數(shù)據(jù)庫和KEGG數(shù)據(jù)庫，將長航組中上述一致性表達升高的細胞因子進行功能分析并歸類。結(jié)果如表3所示，13個差異細胞因子主要與細胞運動(8/13，61.54%)和細胞生長調(diào)節(jié)(5/13，38.46%)密切相關(guān)。其中，前者以趨化因子(6/13，46.15%)為主，后者包括生長因子及其受體(3/13，23.08%)與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(2/13，15.38%)。涉及細胞因子及其受體相互作用(cytokine-cytokine receptor interaction)、有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、Janus 激酶-信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄活化因子(janus kinase-signal transducer and transcription，Jak-STAT)和天然殺傷細胞介導細胞毒性(natural killer cell mediated cytotoxicity pathway，NCMC)等信號通路，參與了包括細胞趨化、免疫調(diào)節(jié)尤其是細胞免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應、細胞增殖和凋亡等重要生物學過程。

表3 一致性表達升高的差異細胞因子功能分類

3 討論

本研究采用人細胞因子抗體芯片定量比較了不同長航人員和岸基人員外周血120種細胞因子表達水平改變。結(jié)果顯示:與岸基人員對照組相比，執(zhí)行長航任務后34.17%(41/120)人體細胞因子表達水平發(fā)生改變。其中，實驗1組和2組差異細胞因子數(shù)分別為32(26.67%，32/120)和26(21.67%，26/120)，除13個細胞因子呈一致性表達升高外，兩組中其余差異因子及其變化均不相同。由于兩組成員都是同批次長航人員，僅在訓練背景和任務分工上有所不同，因此研究中重點關(guān)注了在兩組中呈一致性表達改變的13個差異細胞因子。

進一步功能分類發(fā)現(xiàn)，上述13個差異細胞因子主要與細胞運動(8/13，61.54%)和細胞生長調(diào)節(jié)(5/18，38.46%)密切相關(guān)。其中，前者以趨化因子(6/8，46.15%)為主，后者包括生長因子及其受體(3/13，23.08%)與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導配體(2/13，15.38%)。涉及 MAPK、Jak-STAT和 NCMC等信號通路，參與了包括細胞趨化、免疫調(diào)節(jié)尤其是細胞免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應、細胞增殖和凋亡等重要生物學過程。

已知趨化因子是一類由分子質(zhì)量較小的蛋白(8～16 ku)組成的、有20%～70%的氨基酸同源性的細胞因子超家族。除了具有調(diào)節(jié)免疫細胞游走、介導免疫反應的功能之外，還涉及到神經(jīng)退行性疾病的炎癥過程，以及參與了與炎癥無關(guān)的細胞生長調(diào)節(jié)、血細胞生成、胚胎發(fā)育、血管生成等多種生物學過程。研究中發(fā)現(xiàn)，呈差異表達的趨化因子在功能上具有共同的特點，即主要表現(xiàn)為較強的T細胞趨化性，與T細胞的定向游走、選擇性歸巢密切相關(guān)，在免疫調(diào)節(jié)尤其是細胞免疫調(diào)節(jié)以及T細胞介導的炎癥反應中具有重要作用。例如I-TAC，在13個差異細胞因子中變化最為顯著。它作為T細胞最重要的趨化因子，能夠誘導T細胞特別是Th1細胞定向遷移、引發(fā)炎癥反應，因而有利于Th1細胞免疫反應。同時，I-TAC還參與調(diào)控血管生成及激活細胞增殖的過程，不僅能夠抑制血管內(nèi)皮細胞生長，調(diào)控血管生成，而且能夠加強抗原對T細胞作用促進T細胞增殖的功能?？赡茉诎琓細胞募集的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如自身免疫性腦脊髓炎、單純皰疹病毒腦炎)和皮膚病(如過敏性接觸性皮炎、扁平苔蘚和蕈樣霉菌病)中具有重要作用［7-8］。皮膚T細胞吸引趨化因子(cutaneous T cell-attracting chemokine，CTACK)，對記憶性T細胞具有較強的趨化作用，而記憶性T細胞選擇性歸巢于皮膚，因此在T細胞介導的皮膚炎癥反應的啟動和維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CTACK在過敏性皮炎和牛皮癬的急慢性皮膚損傷，以及銀屑病患者皮損和血清中都有高表達［9］。提示，長航后，人體免疫系統(tǒng)出現(xiàn)失衡，T細胞功能異常活躍，由T細胞介導的細胞免疫應答及炎癥反應被廣泛激活。而差異細胞因子中細胞生長調(diào)節(jié)蛋白的表達增高可能是前者引起的反應性增高，考慮與免疫/炎癥反應后的組織修復有關(guān)。當然，該結(jié)論還有待于進一步在大樣本群中進行驗證。

推測引起上述變化的原因可能與長航特殊的作業(yè)環(huán)境有關(guān)。當今現(xiàn)代化艦船大多具有全球、全天候、遠距離和長時間的航行性能。艦船在海上遠距離和長期航行時，艦員不僅受到艦船周圍環(huán)境中各種物理、化學因素的影響，而且還受到航海條件對心理因素的影響。首先，茫茫大海危機四伏，艦員不僅要保障自身安全，通常還肩負著某些重要使命，因此超負荷的訓練強度和作業(yè)任務是對艦員身體的嚴峻考驗，不能排除艦員罹患某些感染或慢性疾病的可能;其次，復雜的海洋水文氣象條件，艦上狹小的工作空間，相對貧乏的飲食補給，以及有限的醫(yī)療衛(wèi)生條件，也是威脅艦員健康的不利因素;最后，長期緊張的精神狀態(tài)，相對單一的生活環(huán)境，在身體疲勞之外，艦員往往還面臨著內(nèi)分泌紊亂以及焦慮、抑郁等多種心理障礙。這種“人-艦艇-環(huán)境”的綜合因素長期作用容易對機體產(chǎn)生疊加和累積效應，影響艦員的免疫乃至整個生理功能，進而導致工作能力下降，發(fā)生疲勞和過勞，甚至引起疾病。

慢性疲勞綜合征(chronic fatigue syndrome，CFS)損害免疫系統(tǒng)，患者會感到持續(xù)疲勞、免疫力下降，還可能出現(xiàn)記憶力減退、注意力難以集中、關(guān)節(jié)和肌肉疼痛、頭疼、淋巴結(jié)節(jié)、喉嚨酸痛等癥狀［10］。認識長遠航作業(yè)中“人-艦艇-環(huán)境”綜合因素對機體影響的特殊性和復雜性，積累科學數(shù)據(jù)，制定合理的衛(wèi)勤保障方案，對提高艦員的綜合戰(zhàn)斗力具有重要意義。本研究發(fā)現(xiàn)海上綜合作業(yè)在一定程度上影響長航任務人員機體免疫功能。提示在執(zhí)行長遠航任務中，除加強任務人員體能訓練、營養(yǎng)供給和醫(yī)療保障外，還應積極開展心理輔導與衛(wèi)生常識教育，普及特殊環(huán)境對人員影響與防護措施知識，從而提高作業(yè)人員保健意識和醫(yī)學衛(wèi)生防護水平，減少傷害，降低發(fā)病率，增強戰(zhàn)斗力。

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Effects of long term voyage of warship on the expression of cytokines in human peripheral blood

XIONG Ming，ZHAO Xiao-hang，ZHU Zhi-ming，XIE Peng，QIAO Yuan-yuan，AN Huai-jie，QU Jia，HE Li-dong
(Center for Basic Medical Science，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

ObjectiveTo investigate the effects of long term voyage of warship on the expression of cytokines in human peripheral blood．MethodsThe RayBio?Human Cytokine Antibody Array C Series 1000 was used to check the expression levels of 120 blood cytokines of warship crew and onshore controls by chemiluminescence hybridization．ResultsAfter the long distance navigation the expression of 34．17%(41/120)cytokines were changed in the blood of the warship crew contrast with the ones onshore controls．Among which，13 kinds of cytokines were increased uniformly，it mainly involved in Jak-ATAT、MAPK and NCMC signal pathways，Which participated in important biology processes such as cell chemotaxis，immunoregulation(especially in cellular immunity regulation)，inflammatory reaction as well as in apoptosis，etc．ConclusionThe integrated factors of"human-warship-environment"during long term voyage can result in changes of the expression of partial blood cytokines，and it may also lead to the disequilibrium of immune function in human body．

Cytokines;Antibody array;Immunological regulation;Long term voyage

R466.61;R821.81

A

2095-3097(2012)01-0013-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2012.01.004

國家自然科學基金(91029725);全軍后勤科研計劃基金資助(AHJ10L002);海后司令部科研計劃基金資助(BHJ09JD11，07-3309)

100048北京，海軍總醫(yī)院基礎(chǔ)醫(yī)學研究中心(熊 鳴，趙曉航，朱智明，解 鵬，喬媛媛，安懷杰，曲 佳，何立東)

趙曉航，E-mail:xhztao@126.com

2012-04-11 本文編輯:徐海琴)