陳波，薄成佳，賈瑞鵬，朱佳庚，李文成，吳然，劉昊，葛余正

(1.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇南京 210009;2.南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京第一醫(yī)院泌尿外科，江蘇南京 210006)

急性腎功能衰竭是臨床上常見的急危重癥，缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)是其主要原因之一，病死率可高達(dá)50% ～80%［1］。近年來，隨著再生醫(yī)學(xué)的蓬勃發(fā)展，干細(xì)胞在急、慢性腎臟疾病治療中的應(yīng)用正日益受到關(guān)注。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell，EPC)作為一種具有定向歸巢、增殖、分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞特性的多能干細(xì)胞，在缺血性心臟病、急性肺損傷、高血壓病等多種疾病的治療領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用［2-4］。Patschan 等［5］報(bào)道，由缺血性損傷動(dòng)員的EPC可對(duì)腎臟缺血組織產(chǎn)生保護(hù)性作用，但其研究未涉及EPC在抗細(xì)胞凋亡方面的作用。因此，我們擬觀察同種異體EPC移植對(duì)腎IRI急性期的治療效果并探討其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

雄性SD大鼠［購自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SPF級(jí))］;EGM-MV培養(yǎng)基(Lonza公司);淋巴細(xì)胞分離液(上海華精生物高科技有限公司);胰酶/EDTA(Gibco公司);兔抗大鼠血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)多克隆抗體(Santa公司);TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒(Roche公司);蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)試劑盒(Bio-Rad);CM-Dil(氯甲基苯甲酰氨熒光染料V-228888)、二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

健康雄性SD大鼠30只，體重230～250 g，隨機(jī)分為EPC移植組(EPC組)、缺血再灌注損傷組(IRI組)和假手術(shù)組，每組10只。EPC組:游離雙側(cè)腎蒂，夾閉雙側(cè)腎蒂45 min，恢復(fù)血流灌注后股靜脈注入0.5 ml經(jīng)CM-Dil標(biāo)記的 EPC懸液(細(xì)胞密度1.0×106L-1);IRI組:游離雙側(cè)腎蒂，夾閉雙側(cè)腎蒂45 min，恢復(fù)血流灌注后股靜脈注入0.5 ml生理鹽水;假手術(shù)組:游離雙側(cè)腎蒂，暴露45 min后股靜脈注入EPC懸液(劑量同EPC組)。分別于建模后72 h處死各組大鼠。

1.3 EPC的分離、培養(yǎng)、鑒定和標(biāo)記

Ficoll密度梯度離心法獲取SD大鼠骨髓源性單個(gè)核細(xì)胞。健康雄性SD大鼠，體重130～150 g，大鼠頸椎脫臼處死，于無菌條件下獲取股骨和脛骨，PBS液沖出骨髓組織，將沖洗液輕置于淋巴細(xì)胞分離液上，2 500 r·min-1離心 30 min，取中間相細(xì)胞層，PBS 清洗2次，加入EGM-2MV培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液［6］，細(xì)胞計(jì)數(shù)后加入25 cm2培養(yǎng)瓶(纖維連接蛋白包被)，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，10 d后可進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色(CD31、CD34、Ⅷ因子)鑒定 EPC 及細(xì)胞活力［7］。

1.4 EPC的標(biāo)記

DMSO 溶解CM-Dil，配成1 g·L-1的分裝溶液。取CM-Dil分裝溶液 1 μl，PBS 液稀釋至2 mg·L-1，重懸于收集培養(yǎng)10 d的EPC沉淀(細(xì)胞密度為1.0×106L-1)中，細(xì)胞接種至25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃孵育5 min，4 ℃再孵育15 min［8］，然后于熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記后的EPC特征。

1.5 觀察內(nèi)容和檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 腎功能的測(cè)定 分別于腎IRI后24、48 h從大鼠尾靜脈采血，分離血清后置于-20℃冰箱保存，使用日立全自動(dòng)生化分析儀酶法測(cè)定大鼠尿素氮(BUN)和肌酐(Scr)濃度。

1.5.2 腎組織病理學(xué)檢查及EPC示蹤 左腎固定、脫水、透明、包埋、切片、HE染色，進(jìn)行病理分析;右腎行冰凍切片，在熒光顯微鏡下觀察EPC的歸巢情況。腎小管損傷定義為腎小管壞死或刷狀緣脫落、管型形成、管腔擴(kuò)張，每張切片計(jì)算10個(gè)視野(×200)。按受損比例進(jìn)行腎小管間質(zhì)損傷程度評(píng)分(HSK):無病變?yōu)?分;＜25%為1分;25%≤損傷比例＜50%為2分;50%≤損傷比例＜75%為3分;≥75%為4分。分值越高表示損傷越重。

1.5.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)，按試劑盒說明書操作，凋亡指數(shù)(apoprotic index，AI)采用以下方法計(jì)算:每張切片至少計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，以每100個(gè)細(xì)胞內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)作為凋亡指數(shù)，用百分?jǐn)?shù)表示。

1.5.4 蛋白質(zhì)印跡檢測(cè) 提取組織蛋白，測(cè)定蛋白濃度，蛋白上樣，行PAGE電泳。轉(zhuǎn)膜，封閉，兔抗大鼠VEGF多克隆抗體4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，曝光、顯影、成像。應(yīng)用Image J圖像分析軟件對(duì)特異性條帶進(jìn)行吸光度分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 EPC分離、培養(yǎng)、鑒定、標(biāo)記及其在IRI腎組織的分布

EPC的形態(tài)學(xué)特征:新獲取的大鼠骨髓源性單個(gè)核細(xì)胞呈圓形，大小不一，胞質(zhì)透亮，胞核清晰。培養(yǎng)2～3 d后即可良好貼壁，4～8 d時(shí)細(xì)胞呈三角形、梭形或不規(guī)則形，并出現(xiàn)細(xì)胞集落，14 d時(shí)呈現(xiàn)EPC特有的條索狀或鋪路石狀，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，生長穩(wěn)定。每代生長時(shí)間為4～6 d，待細(xì)胞融合到80%進(jìn)行傳代，可獲得大量的、穩(wěn)定的 EPC［7］。

采用倒置熒光顯微鏡觀察培養(yǎng)的EPC，在綠色光的激發(fā)下，CM-Dil標(biāo)記的EPC發(fā)出紅色熒光，而未標(biāo)記的EPC未發(fā)出紅色熒光，提示已成功標(biāo)記了EPC，標(biāo)記率接近100%(圖1A)。移植組腎組織冰凍切片示:EPC移植后72 h可見CM-Dil陽性細(xì)胞彌散分布在腎臟皮髓交界處，發(fā)出紅色熒光，形態(tài)與培養(yǎng)的EPC符合(圖1B)。而IRI組和假手術(shù)組組未見CM-Dil陽性細(xì)胞，提示細(xì)胞來源于經(jīng)股靜脈移植入大鼠體內(nèi)的EPC。

圖1 EPC標(biāo)記和示蹤Fig 1 EPC labeling and trace

2.2 EPC對(duì)IRI后腎功能的影響

腎 IRI后24 h，EPC 組、IRI組大鼠 BUN、Scr水平較假手術(shù)組顯著升高;腎IRI后48 h，EPC組、IRI組大鼠BUN、Scr水平仍高于假手術(shù)組;且 EPC組大鼠BUN、Scr水平較同一時(shí)間點(diǎn)的IRI組均有顯著降低，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

腎IRI后24 h，移植組與 IRI組比較，BUN:F=11.968，P ＜0.05;Scr:F=14.269，P ＜0.05。移植組與假手術(shù)組比較，BUN:F=101.128，P＜0.01;Scr:F=17.142，P ＜0.05。腎 IRI后48 h，移植組與 IRI組比較，BUN:F=26.32，P ＜0.01;Scr:F=14.269，P ＜0.05。移植組與假手術(shù)組比較，BUN:F=15.366，P＜0.05;Scr:F=16.651，P ＜0.05。

2.3 EPC對(duì)IRI后腎組織損傷的影響

腎IRI后72 h，HE染色示假手術(shù)組腎組織結(jié)構(gòu)正常，IRI組大鼠腎臟病理損傷顯著，主要集中于皮髓交界和外髓的近端小管，表現(xiàn)為小管上皮細(xì)胞壞死、脫落、空泡變性，刷狀緣脫落明顯，部分腎小管基膜裸露形成裸膜，管腔中可見脫落的小管上皮細(xì)胞，間質(zhì)水腫，炎癥細(xì)胞浸潤。EPC組亦可見空泡變性，但腎組織損傷程度較對(duì)照組明顯減輕(圖2)。

圖2 腎組織HE染色Fig 2 HE staining of renal tissue

腎小管損間質(zhì)傷程度評(píng)分:IRI后72 h，EPC組的HSK評(píng)分為2.0±0.1，低于 IRI組(3.0±0.2)(H=95.386，P ＜0.01)，高于假手術(shù)組(0.5±0.2)(H=26.074，P ＜0.01)。

2.4 EPC對(duì)IRI后腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

腎IRI后72 h，IRI組可見明顯的腎小管上皮細(xì)胞凋亡(TUNEL陽性)，凋亡細(xì)胞主要集中在皮髓交界和外髓質(zhì)，腎小球內(nèi)凋亡細(xì)胞較少。IRI組細(xì)胞凋亡指數(shù)(29.7±6.7)較IRI組(66±10.5)顯著降低(P＜0.01)，而假手術(shù)組幾乎未見凋亡細(xì)胞(圖3、4)。

圖3 腎組織凋亡細(xì)胞染色Fig 3 Staining of renal tubular epithelial cell apoptosis

2.5 EPC對(duì)IRI后VEGF蛋白表達(dá)的影響

與假手術(shù)組相比，再灌注后72 h EPC組和IRI組VEGF蛋白表達(dá)升高，但EPC組表達(dá)量顯著高于IRI組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖4、5)。

圖4 各組大鼠VEGF蛋白表達(dá)的比較Fig 4 The effect of EPC transplantation on VEGF by Western blotting analysis

圖5 各組大鼠VEGF蛋白表達(dá)的比較Fig 5 The effect of EPC transplantation on VEGF by Western blotting analysis

3 討 論

EPC作為一種定向分化為內(nèi)皮細(xì)胞的骨髓源性干細(xì)胞，可對(duì)多種器官缺血性損傷產(chǎn)生修復(fù)作用［2-3，9］，逐漸引起了人們的重視。創(chuàng)傷、缺血、缺氧等因素均可刺激骨髓中EPC向外周血遷移、動(dòng)員，對(duì)損傷的血管內(nèi)皮產(chǎn)生修復(fù)作用［10］。但自身動(dòng)員的EPC數(shù)量較少，不足以修復(fù)受損組織［11］，因此，EPC的體外擴(kuò)增和移植為EPC研究的重要手段。

本實(shí)驗(yàn)通過體外分離、誘導(dǎo)、純化、培養(yǎng)EPC并進(jìn)行外源性移植入腎IRI大鼠，在移植后的24和48 h，EPC組大鼠腎功能相關(guān)指標(biāo)雖高于假手術(shù)組，但其損傷程度較IRI組有明顯改善，提示EPC移植在腎IRI早期即可發(fā)揮保護(hù)作用。EPC移植后72 h，移植大鼠腎組織內(nèi)可見CM-Dil陽性EPC，主要位于腎臟皮髓交界處，而假手術(shù)組和IRI組未見CM-Dil陽性細(xì)胞，說明EPC能感知腎組織損傷而向損傷部位歸巢，對(duì)血管內(nèi)皮產(chǎn)生修復(fù)作用，保護(hù)受損腎臟。同時(shí)，EPC組的HSK評(píng)分及病理損傷程度顯著低于IRI組，表明移植的EPC可能會(huì)啟動(dòng)內(nèi)源性再生，促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞自身的增殖、分化從而發(fā)揮修復(fù)作用［12-13］。

本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，在腎IRI后72 h，損傷腎組織不但存在腎小管空泡變性和細(xì)胞壞死脫落，還存在大量的凋亡細(xì)胞。凋亡是細(xì)胞死亡的特殊類型，與細(xì)胞壞死比較，凋亡(尤其是病變的早期)更容易通過藥理學(xué)途徑的干預(yù)得到逆轉(zhuǎn)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，IRI組大鼠的腎小管上皮細(xì)胞核TUNEL陽性比例較高，給予EPC移植后，凋亡指數(shù)明顯降低，提示EPC移植有助于減輕IRI大鼠腎小管上皮細(xì)胞的凋亡，阻止腎損害的進(jìn)展。

細(xì)胞凋亡受多種因素的調(diào)控，而VEGF是被公認(rèn)的內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞凋亡的抑制劑［14］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，EPC組VEGF含量顯著高于IRI組及假手術(shù)組，移植的EPC可能通過自分泌/旁分泌作用分泌VEGF等細(xì)胞因子，對(duì)抗凋亡，這可能是對(duì)抗腎小管上皮細(xì)胞凋亡的重要因素，但確切的機(jī)制尚需進(jìn)一步探討。

［1］SCHRIER R W，WANG W，POOLE B，et al.Acute renal failure:definitions，diagnosis，pathogenesis，and therapy［J］.J Clin Invest，2004，114(1):5-14.

［2］范國峰，馮毅，童嘉毅.超聲聯(lián)合微泡對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞體外增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響［J］.東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2009，28(2):109-112.

［3］趙紅杰，劉玲，楊毅.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞/內(nèi)皮祖細(xì)胞治療急性肺損傷的研究進(jìn)展［J］.東南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2011，30(3):530-532.

［4］張鐵須，周建中.內(nèi)皮祖細(xì)胞與高血壓?。跩］.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)，2008，36(2):141-143.

［5］PATSCHAN D，KRUPINCZA K，PATSCHAN S，et al.Dynamics of mobilization and homing of endothelial progenitor cells after acute renal ischemia:modulation by ischemic preconditioning［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2006，291(1):F176-185.

［6］YANG N，LI D，JIAO P，et al.The characteristics of endothelial progenitor cells derived from mononuclear cells of rat bone marrow in different culture conditions［J］.Cytotechnology，2011，63(3):217-226.

［7］曹樸，薛建新，賈瑞鵬，等.內(nèi)皮祖細(xì)胞對(duì)大鼠睪丸扭轉(zhuǎn)復(fù)位后生精功能的影響［J］.中華醫(yī)學(xué)雜志，2011，91(30):2135-2138.

［8］EDALATMANESH M A，BAHRAMI A R，HOSSEINI E，et al.Neuroprotective effects of mesenchymal stem cell transplantation in animal model of cerebellar degeneration［J］.Neurol Res，2011，33(9):913-920.

［9］LIU F，LIU Z D，WU N，et al.Transplanted endothelial progenitor cells ameliorate carbon tetrachloride-induced liver cirrhosis in rats［J］.Liver Transpl，2009，15(9):1092-1100.

［10］HOHENSTEIN B，KUO M C，ADDABBO F，et al.Enhanced progenitor cell recruitment and endothelial repair after selective endothelial injury of the mouse kidney［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2010，298(6):F1504-1514.

［11］di MARCO G S，RUSTEMEYER P，BRAND M，et al.Circulating endothelial progenitor cells in kidney transplant patients［J］.PLoS One，2011，6(9):e24046.

［12］BASILE D P.Challenges of targeting vascular stability in acute kidney injury［J］.Kidney Int，2008，74(3):257-258.

［13］BECHERUCCI F，MAZZINGHI B，RONCONI E，et al.The role of endothelial progenitor cells in acute kidney injury［J］.Blood Purif，2009，27(3):261-270.

［14］GALANI V，TATSAKI E，BAI M，et al.The role of apoptosis in the pathophysiology of Acute Respiratory Distress Syndrome(ARDS):an up-to-date cell-specific review［J］.Pathol Res Pract，2010，206(3):145-150.