代煒，姚遠(yuǎn)，李彥姝，張紅艷，李妍，秦興軍

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科，口腔頜面-頭頸腫瘤外科，遼寧沈陽(yáng) 110002;2.遼寧省人民醫(yī)院消化內(nèi)科，遼寧沈陽(yáng) 110016;3.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)教研室，細(xì)胞生物學(xué)衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧沈陽(yáng) 110001)

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)是誘導(dǎo)侵襲轉(zhuǎn)移的因子，在腫瘤不同時(shí)期起到了雙重的作用［1］。在腫瘤早期它可作為腫瘤抑制因子，但在腫瘤晚期它可促進(jìn)腫瘤的形成。TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的腫瘤抑制功能主要是通過抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和復(fù)制衰老［2］來完成。TGF-β信號(hào)抗增殖作用依賴于下調(diào)c-Myc和上調(diào)CDK 抑制劑，如 P15INK4B 和 p21 CIP/WAF1［3-4］。另外，TGF-β信號(hào)能夠促進(jìn)上皮間質(zhì)化(EMT)，在腫瘤運(yùn)動(dòng)、侵襲和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。TGF-β也能夠通過活化磷酸肌醇3激酶(PI3K)和Akt通路促進(jìn)細(xì)胞生存［5］。TGF-β在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增高與預(yù)后不良和轉(zhuǎn)移相關(guān)。通過結(jié)合異源受體復(fù)合物1(TβR1)和2(TβR2)來發(fā)揮生物學(xué)作用。TGF-β誘導(dǎo)異源二聚體的形成，TβR2磷酸化 TβR1?；罨?TβR1通過磷酸化Smads受體(R-Smads)如Smad2和Smad3來激起細(xì)胞內(nèi)的典型的信號(hào)通路。這些活化的R-Smads與Smad4形成了異源復(fù)合物，Smad4在核內(nèi)富集調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄［6-7］。

TGF-β的作用依賴于上下通路的激活，目前TGF-β/TβR1通路對(duì)人頭頸鱗狀細(xì)胞癌侵襲的影響還是不清楚。我們構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá) TGF-β1受體 TβR1的UM-SCC-23鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系，發(fā)現(xiàn)基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)的表達(dá)明顯上調(diào)。MMPs是細(xì)胞外基質(zhì)降解酶，在炎癥和血管生成中起到至關(guān)重要的作用。MMP2(也叫2型膠原酶或明膠酶A)是調(diào)節(jié)侵襲及腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的重要因子。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株與載體 UM-SCC-23細(xì)胞株為本實(shí)驗(yàn)室保存，pcDNA3.1-His-TβR1真核表達(dá)載體為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，載體上含有Neomycin阻抗基因，能夠被G418篩選。

1.1.2 試劑 RNA提取試劑Trizol(Invitrogen);逆轉(zhuǎn)錄和 Real-time PCR試劑盒(TaKaRa);引物合成(Invitrogen);TβR1抗體(cell signaling);二抗(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);DMEM培養(yǎng)基和血清(Hyclone)。

1.2 方法

1.2.1 穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建 將pcDNA3.1對(duì)照載體和pcDNA3.1-TβR1融合載體用 Lipofectamine 2000TM瞬時(shí)轉(zhuǎn)染UM-SCC-23，操作步驟按照Invitrogen公司說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染48 h后，用G418篩選10 d，待細(xì)胞形成單克隆后，挑取單克隆細(xì)胞到24孔板中，繼續(xù)用G418進(jìn)行篩選。用蛋白質(zhì)印跡法篩選穩(wěn)定表達(dá)TβR1的細(xì)胞。

1.2.2 RNA提取和Real-time PCR檢測(cè) 利用Trizol從穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1和pcDNA3.1-His-TβR1載體的UM-SCC-23細(xì)胞中提取總RNA，操作步驟按照Invitrogen公司Trizol說明書進(jìn)行。Real-time PCR按照TaKaRa公司的SYBR green試劑操作說明進(jìn)行。Primer Premier 5.0生物分析軟件設(shè)計(jì)MMP2(BC002576.2)引物，MMP2引物序列為上游5'-TGGCAAGGAGTACA ACAGC-3';下 游 5'-TGGAAGCGGAATGGAAAC-3'。GAPDH(NM_001256799.1)作為內(nèi)參校正組間誤差。GAPDH上游5'-GACCTGACCTGCCGTCTA-3';下游5'-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3'。

1.2.3 蛋白質(zhì)的提取與蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)MMP2表達(dá) 細(xì)胞中加入50 μl含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上孵育20 min，將細(xì)胞裂解液13 000×g，4℃離心30 min。取上清液到新的離心管中，5 μl進(jìn)行定量。將蛋白定量后，取 20 μg總蛋白經(jīng) 10%SDSPAGE凝膠分離，4℃過夜恒壓轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉3 h，TBST洗膜15 min，3次。加入anti-MMP2抗體(1∶2 000稀釋)，TBST 洗膜15 min，3次。再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔(1∶5 000稀釋，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)孵育2 h，TBST洗膜15 min，3次。ECL顯色，壓片。將膜上抗體脫掉后，重新封閉，加入內(nèi)參抗體β-actin抗體(1∶6 000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)作為對(duì)照［8-9］。

1.2.4 細(xì)胞侵襲性實(shí)驗(yàn) 基質(zhì)膠侵襲試驗(yàn)是在有聚碳酸酯核孔膜的改良boyden小室中進(jìn)行。鋪膠濾膜(直徑6.5 mm，核孔為 8 μm，基底膜 100 μg·cm-2)用100 μl的培養(yǎng)基進(jìn)行水化。在上層小室中加入100 μl含0.1%牛血清白蛋白的DMEM培養(yǎng)基，下層放入600 μl含有10%血清的DMEM培養(yǎng)基。在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，非侵襲細(xì)胞用棉簽從上層表面移走。侵襲細(xì)胞在下層被固定，染色，照相，封片，并進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 成功構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)TβR1的 UM-SCC-23細(xì)胞系

pcDNA3.1為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染對(duì)照空載體，TβR1 1～3#為3個(gè)不同的穩(wěn)轉(zhuǎn)克隆，2#克隆表達(dá)TβR1蛋白明顯升高，而1#和3#克隆TβR1蛋白略有增高表達(dá)。用GAPDH做為內(nèi)參，檢測(cè)上樣總量一致。見圖1。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系TβR1蛋白表達(dá)Fig 1 Western blotting analysis shows the protein level of TβR1 in control vector(pcDNA3．1)and TβR1 stable cell lines

2.2 TβR1上調(diào)MMP2基因表達(dá)

將穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1空對(duì)照和穩(wěn)定表達(dá)TβR1(1～3#)的UM-SCC-23細(xì)胞系提取總RNA、反轉(zhuǎn)錄，利用MMP2特異性引物進(jìn)行Real-time PCR檢測(cè)MMP2基因水平變化，當(dāng)TβR1-2#過表達(dá)時(shí)，MMP2表達(dá)也明顯增強(qiáng)(圖2)。

圖2 Real-time PCR檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中MMP2基因表達(dá)Fig 2 Real-time PCR analysis shows the gene expression of MMP2 in control vector(pcDNA3．1)and TβR1 stable cell lines

2.3 TβR1上調(diào)MMP2蛋白表達(dá)

將穩(wěn)定表達(dá)pcDNA3.1空對(duì)照和穩(wěn)定表達(dá)TβR1(1～3#)的UM-SCC-23細(xì)胞系提取總蛋白，進(jìn)行SDSPAGE和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)MMP2蛋白水平變化，當(dāng)TβR1-2#過表達(dá) TβR1時(shí)，MMP2蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(圖3)。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系中MMP2基因表達(dá)Fig 3 Western blotting analysis shows the protein level of MMP2 in control vector(pcDNA3．1)and TβR1 stable cell lines

2.4 TGF-β/TβR1通路促進(jìn)頭頸腫瘤細(xì)胞的侵襲

利用Boyden小室鋪膠實(shí)驗(yàn)證實(shí)，穩(wěn)定表達(dá)TβR1的UM-SCC-23細(xì)胞系與穩(wěn)定表達(dá)空載體的細(xì)胞系相比較侵襲能力明顯增強(qiáng)。

圖4 TGF-β/TβR1通路促進(jìn)頭頸鱗狀細(xì)胞癌的侵襲Fig 4 TGF-β/TβR1 promotes invasion of human head and neck squamous cell carcinoma cells

3 討 論

TGF-β信號(hào)通路在發(fā)育和疾病中發(fā)揮了重要的作用。TGF-β能夠啟動(dòng)細(xì)胞表面的受體TβR1和TβR2的信號(hào)通路。TβR1磷酸化R-Smad是作為Smad活化的重要步驟，需要受體與Smads之間發(fā)生直接的相互作用。TβR1在L45環(huán)區(qū)域與R-Smads的L3環(huán)區(qū)域特異性的結(jié)合區(qū)［10-11］。

MMPs是一類需要鋅離子進(jìn)行催化作用的分泌蛋白酶，能夠分泌到細(xì)胞外基質(zhì)作為酶原的催化物，能夠被多種組織抑制物(TIMP)抑制活性［12］。根據(jù)它們的底物特異性和結(jié)構(gòu)相似性可分為多種亞類:(1)間質(zhì)膠原酶;(2)明膠;(3)基質(zhì)降解酶;(4)MT-MMPs。MMPs能夠通過多種機(jī)制調(diào)節(jié)侵襲，包括通過腫瘤細(xì)胞生產(chǎn)酶，在鄰近基質(zhì)、內(nèi)皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞中誘導(dǎo)MMPs生產(chǎn)，這些細(xì)胞之間的相互作用也能夠誘導(dǎo)MMPs生產(chǎn)［13］。R-Smads 能夠 被 MAPKs、CDK2/4、GSK-3β和ROCK等激酶所磷酸化。

本研究首先將TGF-β的受體TβR1穩(wěn)定表達(dá)于UM-SCC-23頭頸鱗狀細(xì)胞癌中，利用蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證了TβR1-2#成功過表達(dá)了TβR1蛋白，這也為我們激活TGF-β/TβR1通路打下了基礎(chǔ)。提取穩(wěn)轉(zhuǎn)了pcDNA3.1和TβR1-(1～3#)的UM-SCC-23細(xì)胞系的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用特異引物擴(kuò)增MMP2基因，結(jié)果顯示在TβR1-2#細(xì)胞系中MMP2基因表達(dá)明顯增高。另外，我們也檢測(cè)了穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的蛋白表達(dá)，在TβR1-2#細(xì)胞系中MMP2蛋白表達(dá)增高。由于MMP2在腫瘤細(xì)胞中能夠促進(jìn)侵襲［14］，我們利用穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系進(jìn)行了細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了TβR1-2#細(xì)胞系與對(duì)照組相比侵襲性明顯增強(qiáng)。

總之，TGF-β/TβR1通路能夠上調(diào)MMP2表達(dá)，促進(jìn)頭頸鱗狀細(xì)胞癌侵襲能力增強(qiáng)，導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移。我們的實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步探索臨床頭頸腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲機(jī)制提出了新的理論依據(jù)，為探索TGF-β/TβR1的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及與腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)系奠定了理論基礎(chǔ)。

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