楊明華, 蘇金珠, 劉 軍, 李亞輝,2,*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 昆明 650201; 2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 昆明 650201)

Tssk1和Tssk2的克隆、表達(dá)及其在成熟精子中的分布與亞細(xì)胞定位

楊明華1,#, 蘇金珠1,#, 劉 軍1, 李亞輝1,2,*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 昆明 650201; 2. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院, 昆明 650201)

睪丸特異性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Testis-Specific Serine/Threonine Kinases, TSSKs)可能在精子發(fā)生和(或)精子功能調(diào)節(jié)中起著重要作用, 該文研究克隆并表達(dá)了小鼠Tssk1和Tssk2基因, 純化得到了Tssk1和Tssk2蛋白激酶, 經(jīng)Western blotting分析, Tssk1和Tssk2皆存在于小鼠和人的成熟精子中。免疫組化的結(jié)果顯示，Tssk1分布于小鼠的頭部(頂體)及整個(gè)尾部, Tssk2主要分布在小鼠精子頭部頂體后的區(qū)域; 獲能前后的小鼠精子其Tssk1及Tssk2分布模式未發(fā)生改變, 小鼠Tssk2在誘發(fā)頂體反應(yīng)前后精子中的分布模式也無(wú)變化。然而, 原來(lái)存在于頂體的Tssk1在誘發(fā)頂體反應(yīng)后由于頂體的丟失而未能檢出其信號(hào), 但尾部的信號(hào)不受影響。在人精子中, Tssk1分布區(qū)域?yàn)轭i部及尾部, Tssk2則分布于赤道板的位置。研究結(jié)果提示，Tssk1和Tssk2可能對(duì)精子功能具有重要調(diào)節(jié)作用。

Tssk蛋白激酶; 睪丸特異性; 精子功能; 磷酸化

精子發(fā)生(spermatogenesis)是精原細(xì)胞在睪丸中經(jīng)過(guò)一系列的增殖、分化變形, 最終形成功能性精子的過(guò)程。精子發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜而有規(guī)律的細(xì)胞分化過(guò)程, 但在所有哺乳動(dòng)物中, 精子發(fā)生的過(guò)程基本一致, 都可分為這樣 3個(gè)時(shí)期：有絲分裂期(spermatocytogenesis)、減數(shù)分裂期(spermatidogenesis)和精子形成期(spermiogenesis)。其中, 精子形成期是精子細(xì)胞的分化變態(tài)過(guò)程, 是精子分化的重要環(huán)節(jié)(Yang et al, 2005)。其間, 圓形的精子細(xì)胞(spermatids)發(fā)生劇烈的形態(tài)變化, 包括細(xì)胞伸長(zhǎng)、細(xì)胞核的濃縮變長(zhǎng)、頂體的形成、染色質(zhì)的濃縮重組、核蛋白的轉(zhuǎn)型、鞭毛、軸絲的發(fā)生及尾的成形分化等。這些顯著變化是由精子形成期所進(jìn)行的基因轉(zhuǎn)錄(Hecht,1988)和蛋白質(zhì)翻譯(Hake et al, 1990)來(lái)調(diào)控的,有些在精子細(xì)胞中翻譯合成的蛋白質(zhì)會(huì)一直保留至成熟精子中。由于后者是高度分化的特異細(xì)胞, 其染色質(zhì)高度濃縮, 既不進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄，也不能進(jìn)行蛋白質(zhì)的翻譯合成, 細(xì)胞活動(dòng)的調(diào)控幾乎都是通過(guò)蛋白質(zhì)翻譯后修飾的方式進(jìn)行。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾及其活性與功能調(diào)節(jié)的重要方式之一, 已表明蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化作用在精子細(xì)胞的分化變態(tài)中起著不可缺少的作用, 有多種蛋白激酶參與精子發(fā)生的調(diào)節(jié)(Sassone-Corsi, 1997)。但是, 僅有少數(shù)幾種蛋白激酶特異表達(dá)于雄性生殖細(xì)胞或睪丸中(Johnson, 2009; Nayak et al, 1998; Shalom & Don,1999; Toshima et al, 1998, 1999; Tseng et al, 1998;Walden & Cowan, 1993)。睪丸特異性絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Testis-Specific Serine/Threonine Kinases,TSSKs)即是這類蛋白激酶中的一個(gè)主要類群。Bielke et al (1994)發(fā)現(xiàn)首個(gè)TSSKs家族成員——小鼠Tssk1, 它是通過(guò)簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR分離出的一種編碼新的絲/蘇氨酸蛋白激酶的 cDNA片段,其表達(dá)產(chǎn)物能專一地識(shí)別睪丸中的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本(1.6 kb和1.4 kb)。隨后, Kueng et al (1997)以Tssk1基因?yàn)樘结? 經(jīng)非嚴(yán)格雜交克隆并描述了小鼠Tssk2基因的分子特征, 并在此基礎(chǔ)上通過(guò)酵母雙雜交系統(tǒng)識(shí)別出小鼠 Tssk1和 Tssk2的一個(gè)作用底物——TSKS。Zuercher et al (2000)及 Visconti et al (2001)采用類似的PCR方法分別克隆出小鼠和人的Tssk3基因。Hao et al (2004)利用 PCR技術(shù)擴(kuò)增出人的Tssk1-Tssk3以及Tssk1和Tssk2的作用底物TSKS,并且, 他們及其他研究人員(Spiridonov et al, 2005;Zuercher et al, 2000)通過(guò)對(duì)人和小鼠基因組的BLAST搜索發(fā)現(xiàn)了Tssk4和Tssk6。到目前為止, 已鑒定和克隆了 TSSKs家族的 5個(gè)成員(即 Tssk1、Tssk2、Tssk3、Tssk4 和 Tssk6), 隨后進(jìn)行的 Northern blotting的研究結(jié)果顯示，TSSKs家族成員僅在睪丸中表達(dá)(Chen et al, 2005; Hao et al, 2004; Visconti et al, 2001; Zuercher et al, 2000)。但是, 有報(bào)道表明，定量RT-PCR的結(jié)果顯示Tssk1和Tssk2除了在睪丸中豐富表達(dá)外, 在其他組織中也有少量表達(dá), 至于這種低水平的表達(dá)是否具有明顯的生理學(xué)意義卻不得而知(Spiridonov et al, 2005)。而所有TSSKs家族成員的 mRNA在睪丸中的表達(dá)量均高于其他組織, 并且小鼠TSSKs的轉(zhuǎn)錄物在出生后24 d的表達(dá)量與其在成年小鼠睪丸中的表達(dá)量相同, 這說(shuō)明各TSSKs家族成員在小鼠睪丸中的mRNA都是在減數(shù)分裂后表達(dá)的(Li et al, 2011)。另外, Kueng et al(1997)利用酵母雙雜交系統(tǒng)從小鼠睪丸 cDNA文庫(kù)中篩選到一個(gè)能與Tssk1和Tssk2相互作用的蛋白質(zhì)——TSKS, 該蛋白(相對(duì)分子質(zhì)量約為 6.5×104)也專一表達(dá)于睪丸組織并可被Tssk1和Tssk2磷酸化。Visconti et al( 2001)用同樣的方法發(fā)現(xiàn)Tssk3在人的睪丸中特異表達(dá)。Zuercher et al(2000)的研究表明，Tssk3表達(dá)于睪丸間質(zhì)細(xì)胞, 但在附睪或精子中卻不表達(dá), 經(jīng)Western blotting檢測(cè), Tssk3蛋白的表達(dá)也與其基因的表達(dá)模式一致。TSSKs這種高度的組織和時(shí)間表達(dá)特異性提示它們可能在精子發(fā)生和(或)精子功能調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用(Bielke et al,1994; Hao et al, 2004; Kueng et al, 1997; Nayak et al,1998; Spiridonov et al, 2005; Visconti et al, 2001)。的確, 初步的研究結(jié)果表明TSSK成員在正常精子的發(fā)生過(guò)程和受精中起關(guān)鍵作用。例如, 敲除Tssk6基因后, 雄性小鼠可產(chǎn)生形態(tài)上大體正常的精子,但精子不具備正常的受精功能(Spiridonov et al,2005); 敲除Tssk1和Tssk2基因同樣導(dǎo)致雄性不育,并表現(xiàn)為精子形態(tài)發(fā)生異常, 如不能形成長(zhǎng)形精子細(xì)胞, 以及精子細(xì)胞中線粒體鞘嚴(yán)重受損等(Shang et al, 2007, 2010; Xu et al, 2008a, 2008b); 臨床上Tssks基因某些位點(diǎn)的單核苷酸突變也可能與男性不育癥相關(guān)(Su et al, 2008; Zhang et al, 2010)。盡管如此, 有關(guān) Tssks在成熟精子中的存在及其定位的研究鮮有報(bào)道, 而通過(guò)免疫組化法檢測(cè)精子執(zhí)行不同功能(未獲能、獲能、頂體反應(yīng))時(shí)Tssks亞細(xì)胞定位的研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，Tssk1和 Tssk2均表達(dá)于成熟的小鼠精子和人精子中, 但兩者的表達(dá)部位不管在何物種都有明顯不同, 這是否暗示著它們?cè)诰庸δ苷{(diào)節(jié)中具有不同的功能。本研究結(jié)果為進(jìn)一步開(kāi)展Tssks對(duì)精子功能的調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

7～8周齡的雄性ICR小鼠用于本實(shí)驗(yàn), 它們均來(lái)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。除特殊說(shuō)明外, 所用的化學(xué)試劑均購(gòu)自Sigma公司(St.Louis, MO, USA)。用于Western blotting 的聚丙烯酰胺(30%)為索萊寶公司產(chǎn)品, 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量marker 為碧云天公司產(chǎn)品, X光片為柯達(dá)公司產(chǎn)品; PVDF膜購(gòu)自Millipore公司, 顯影粉和定影粉購(gòu)自天津世紀(jì)奧博商貿(mào)有限公司, GST標(biāo)簽重組人Tssk1和Tssk2蛋白購(gòu)自Abnova公司, 小鼠單克隆抗 Tssk1抗體(clone 4F12)和抗 Tssk2抗體(clone 1E12)購(gòu)自 Abnova(臺(tái)灣)公司, Alexa-Fluor-555 二抗(羊抗鼠)、Alexa-Fluor-488 PNA、DAPI 均購(gòu)自Invitrogen公司, HRP-抗鼠IgG抗體購(gòu)自Abcam公司, 引物合成及 DNA測(cè)序在上海生工生物工程公司進(jìn)行。

1.2 小鼠Tssk1 和Tssk2的克隆

1.2.1 小鼠睪丸總 RNA的抽提和 cDNA的合成總RNA的抽提采用TINGEN 公司的Trizol 試劑,將小鼠睪丸放入加有液氮的研缽中, 不斷研磨使成粉末, 待液氮揮發(fā)完以后, 按 50～100 mg組織/mL Trizol 加入Trizol, 室溫放置10 min, 使其充分裂解,12 000 r/min 離心 5 min, 棄沉淀; 按 200 μL 氯仿/mL Trizol加入氯仿, 振蕩混勻后室溫放置15 min,4℃, 12 000g離心15 min, 取上層水相于一新離心管中, 按0.5 mL異丙醇/mL Trizol加入異丙醇混勻,室溫放置5～10 min, 4℃, 12 000g離心10 min, 棄上清, 回收沉于管底的RNA, 按1 mL 75%乙醇/mL Trizol加入 75%乙醇, 溫和振蕩離心管, 懸浮沉淀,4 ℃, 8 000g離心5 min, 棄上清, 室溫晾干或真空干燥5～10 min。用無(wú)RNase 的滅菌水溶解沉淀, 取少許用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性, 其余的置于－80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1 g 總RNA 用于cDNA 第一鏈的合成，合成步驟按Reverse Transcription System 反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自TINGEN公司。所用引物系根據(jù)NCBI上NM_009435(Tssk1)和 NM_009436(Tssk2)的序列分別自行設(shè)計(jì)的Tssk1和Tssk2特異引物(Tssk1:Sense:5'-ATGTCTGGCAGGGATGTA G-3'Antisense:5'-GCTTCTTTAGCCGTGTGAG-3';Tssk2：Sense：5'-TGGGAATGAGGACAATGC-3',Antisense：5'-CTGCACACCACGATACCC-3')。RTPCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min; 94 ℃變性30 s, 55℃復(fù)性30 s, 72 ℃延伸90 s, 共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán); 72℃ 延伸10 min。反應(yīng)完畢后取2 μL 進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳分析。

用1%瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR 產(chǎn)物, 進(jìn)行 TOPO TA 連接與轉(zhuǎn)化, 用藍(lán)白斑法挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行 PCR, 委托上海生工生物工程公司進(jìn)行DNA 序列測(cè)定。

1.2.2 小鼠Tssk1和Tssk2的亞克隆及蛋白表達(dá)與純化 亞克?。簩y(cè)序完全正確的Tssks菌株培養(yǎng)后提取質(zhì)粒作為模板, 分別把Tssk1和Tssk2的開(kāi)放閱讀框(ORF) 亞克隆進(jìn) PGEX-5X-1表達(dá)載體,所用的亞克隆引物分別為T(mén)ssk1引物：Sense： 5'-CC GGAATTCATGGATGACGCTGCCGTCC-3'(帶EcoRⅠ酶切位點(diǎn))Antisense：5'-ATTTGCGGCCGCATCT AAGTATGTGTCTCTGAAGG-3'(帶 Not I酶切位點(diǎn));Tssk2引物：Sense：5'-GAATTCATGGACGATGCG GCGGTCCTA-3'(帶 EcoRⅠ酶切位點(diǎn)), Antisense：5'-GTCGACTCCTAGGTACTTGCTTTCTCCAC-3'(帶Sal I酶切位點(diǎn))。PCR程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 sec, 55 ℃復(fù)性30 sec, 72 ℃延伸90 s,共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán); 72 ℃ 延伸10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳純化回收PCR 產(chǎn)物, 進(jìn)行TOPO TA 連接與轉(zhuǎn)化, 挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR,提取其質(zhì)粒, 對(duì)目的片段及表達(dá)載體(pGEX-5X-1)進(jìn)行酶切, 然后用T4連接酶將其連接(16 ℃連接過(guò)夜)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌后用藍(lán)白斑篩選, 搖菌后進(jìn)行菌液 PCR,陽(yáng)性結(jié)果樣品, 一部分用于測(cè)序(委托上海生工生物工程公司進(jìn)行), 剩下的用甘油冷凍保存于－80℃冰箱。

蛋白表達(dá)與純化：將測(cè)序正確的菌株提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)化到BL21, 用IPTG誘導(dǎo)Tssks蛋白的表達(dá), 菌液于4 ℃, 3 000g離心10 min, 棄上清。用預(yù)冷的1×PBS(pH8.0)重懸菌體(3 mL PBS/50 mL菌液), 4℃, 3 000g離心10 min, 棄上清。加入預(yù)冷PBS(含PMSF和 EDTA), 用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞,超聲處理3次, 每次30 s。4 ℃, 12 000離心10 min,將上清轉(zhuǎn)移至一新離心管中, 加入預(yù)冷PBS后上柱,平衡后用20倍柱床體積的含有PMSF的1xPBS進(jìn)行清洗。然后用10～15倍柱床體積的谷胱甘肽洗脫液(0.154 g還原型谷胱甘肽溶解于50 mL 50 mmol/L的Tris-HCl, pH8.0)洗脫GST融合蛋白。洗脫4次,分別收集4次洗脫液, 進(jìn)行Western blotting分析。

1.3 小鼠和人精子的制備

將性成熟的ICR小鼠脫頸處死, 取附睪尾并在其上剪幾個(gè)開(kāi)口, 將剪過(guò)的附睪置于 Whitten’s 液中, 37 ℃水浴處理10 min讓精子游出來(lái), 取少許鏡檢、計(jì)數(shù), 其余精子用做獲能、頂體反應(yīng)、免疫組化、Western blotting等實(shí)驗(yàn)。精子獲能參照Visconti et al (1995)報(bào)道的方法進(jìn)行, 即：將洗滌后的精子置于成分完全的Whitten’s 液中, 于37 ℃孵育90 min;頂體反應(yīng)的誘發(fā)：洗滌后的精子于37 ℃ Whitten’s液中孵育 60 min 后, 加入 10 μmol/L Ca2+載體A23187 再孵育30 min 即可 。人精液先經(jīng)液化處理1 h, 然后在37 ℃的mHTF溶液中上游1 h, 離心洗滌后用于免疫組化或Western blotting分析。

1.4 SDS-PAGE和Western blotting分析

在細(xì)胞或精子提取物中加入適量的Laemmli緩沖液, 煮沸5 min, 13 000 r/min, 離心5 min。將上清轉(zhuǎn)至新離心管中, －20 ℃或－80 ℃保存?zhèn)溆?。電泳前加?%的β-巰基乙醇煮沸2 min, 在12%分離膠, 5%濃縮膠中進(jìn)行SDS-PAGE電泳, 每個(gè)泳道精子量為1×106～2×106。電泳結(jié)束后, 將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上, 用含5%脫脂乳的T-TBS室溫下封閉1 h (Jha et al, 2006), 分別與一抗、二抗孵育后用ECL顯色。

1.5 小鼠和人精子免疫熒光染色

小鼠或人精子經(jīng)處理、洗滌后將其加于載玻片上的小孔中, 晾干后用 3.7%的甲醛于室溫下固定20 min, 用含有0.1%Tween20的PBS洗3次, 每次5 min。 用含0.5%Triton X-100的PBS透膜5 min(室溫)。用含有0.1%Tween20的PBS洗 3次, 每次5 min。

用封閉液(含有10%BSA的PBS)封閉(室溫2 h或在濕盒里4 ℃過(guò)夜)。加入相應(yīng)的一抗(室溫下結(jié)合2 h, 或在濕盒里4 ℃過(guò)夜)。PBS洗3次, 每次10 min。加入二抗及PNA和DAPI, 室溫孵育至少2 h。PBS洗10次, 每次2 min。去除多余液體后封片,放4 ℃避光過(guò)夜。次日鏡檢, 拍照。以添加二抗而不添加一抗的精子作為陰性對(duì)照組, 檢測(cè)二抗的假陽(yáng)性情況。免疫標(biāo)記的精子用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠Tssk1和Tssk2蛋白表達(dá)及提取純化

在成功克隆出小鼠Tssk1和Tssk2的基礎(chǔ)上, 本研究建立了小鼠Tssk1和Tssk2蛋白的原核表達(dá)體系, 用谷胱甘肽樹(shù)脂提取純化了帶有GST標(biāo)簽的重組小鼠Tssk1和Tssk2蛋白, 經(jīng)Western blotting檢測(cè), 在第一次和第二次洗脫液中檢出相對(duì)分子質(zhì)量為 6.6×104～6.7×104的蛋白分子, 與預(yù)期的GST-Tssk1和GST-Tssk2 相對(duì)分子質(zhì)量一致(圖1)。

圖1 小鼠Tssk1(A)和Tssk2(B)蛋白提取純化Fig. 1 Purified mouse Tssk1(A) and Tssk2 (B) protein

2.2 小鼠Tssk1和Tssk2蛋白免疫印跡分析

如圖2 所示, 抗Tssk1的抗體不但能識(shí)別重組小鼠Tssk1蛋白, 而且還能識(shí)別重組小鼠Tssk2蛋白,此外, 經(jīng)Western blotting分析, 在成熟的小鼠精子中有 Tssk1蛋白的存在; 圖 2 B 的結(jié)果顯示, 抗Tssk2的抗體既能識(shí)別重組小鼠Tssk2蛋白, 又能識(shí)別重組小鼠Tssk1蛋白, 而且, 用抗Tssk2的抗體在成熟小鼠精子中檢測(cè)到2種蛋白, 其中之一可能是Tssk2蛋白激酶翻譯后修飾的一種形式。如圖 2 A和 B所示, 抗 Tssks的抗體能同時(shí)識(shí)別小鼠重組Tssk1和Tssk2, 很可能是由于Tssk1和Tssk2有較高同源性之故。

圖2 小鼠Tssk1(A)和Tssk2(B)蛋白免疫印跡分析Fig. 2 Western blotting of mouse Tssk1(A) andTssk2(B)

2.3 人Tssk1和Tssk2蛋白免疫印跡分析

Western blotting的結(jié)果顯示, Tssk1和Tssk2蛋白分別存在于射出的人精子中(圖 3), 而且, 與小鼠的情況不同, 抗 Tssks的抗體只能識(shí)別相應(yīng)的重組人Tssk蛋白(圖 3)。像小鼠一樣, 用抗 Tssk2的抗體在射出的人精子中檢測(cè)到2種蛋白(圖 3 B)。

2.4 Tssk1和Tssk2在小鼠和人精子中的亞細(xì)胞定位

2.4.1 Tssk1和Tssk2在小鼠精子(未獲能、獲能和頂體反應(yīng))中的亞細(xì)胞定位 我們用免疫組化方法檢測(cè)了Tssk1和Tssk2在小鼠未獲能、獲能及頂體反應(yīng)精子中的分布與定位, 發(fā)現(xiàn) Tssk1主要分布于小鼠精子的頭部(頂體)和整個(gè)尾部且在獲能前后其分布模式未發(fā)生改變, 但原來(lái)存在于頂體的 Tssk1在頂體反應(yīng)后隨頂體的丟失而丟失(圖 4A)。Tssk2主要分布于小鼠精子頭部頂體后區(qū)域, 其分布模式在獲能前后、頂體反應(yīng)后均未發(fā)生改變(圖 4B)。

2.4.2 Tssk1和 Tssk2在人精子中的亞細(xì)胞定位經(jīng)免疫熒光檢測(cè), Tssk1分布于人精子頸部及整個(gè)尾部(圖 5A), Tssk2則分布于人精子赤道板附近(圖

5B)。與小鼠精子一樣, 人精子中Tssk1和Tssk2 在獲能前后、頂體反應(yīng)后的分布模式也無(wú)改變(數(shù)據(jù)未顯示)。

圖3 人Tssk1(A)和Tssk2(B)蛋白免疫印跡分析Fig. 3 Western blotting of human Tssk1(A) and Tssk2(B)

3 討 論

圖4 Tssk1(A)和Tssk2(B)在成熟小鼠精子中的亞細(xì)胞定位Fig. 4 Subcellular localization of Tssk1 (A) and Tssk2 (B) in mature mouse sperm

圖5 Tssk1(A)和Tssk2(B)在成熟人精子中的亞細(xì)胞定位Fig. 5 Subcellular localization of Tssk1(A) and Tssk2(B) in mature human sperm

迄今為止, 已鑒定和克隆了TSSKs家族的5個(gè)成員，即Tssk1、 Tssk2、 Tssk3、 Tssk4 和Tssk6。Northern blotting 的研究結(jié)果顯示，TSSKs家族成員僅在睪丸中表達(dá)(Visconti et al, 2001; Hao et al,2004; Zuercher et al, 2000; Chen et al, 2005)；但是,有報(bào)道表明定量 RT-PCR的結(jié)果顯示，Tssk1和Tssk2除了在睪丸中豐富表達(dá)外, 在其他組織中也有少量表達(dá), 至于這種低水平的表達(dá)是否具有明顯的生理學(xué)意義卻不得而知(Spiridonov et al, 2005)。而所有TSSKs家族成員的mRNA在睪丸中的表達(dá)量均高于其他組織, 并且小鼠TSSKs的轉(zhuǎn)錄物在出生后 24 d的表達(dá)量與其在成年小鼠睪丸中的表達(dá)量相同, 這說(shuō)明各TSSKs家族成員在小鼠睪丸中的mRNA都是在減數(shù)分裂后表達(dá)的(Li et al, 2011)。 Li et al (2011)的研究表明，Tssks的mRNA和蛋白在減數(shù)分裂后的精子細(xì)胞中均有表達(dá), 提示這些蛋白激酶可能參與精子形成的調(diào)節(jié)過(guò)程。Li et al (2011)用多種抗體檢測(cè)了Tssks在小鼠和人成熟精子中的蛋白表達(dá)情況, 除Tssk3外, 其余Tssks蛋白在兩個(gè)物種的成熟精子中都有表達(dá)。本研究中只使用了抗Tssk1及 Tssk2的抗體來(lái)檢測(cè)它們?cè)诔墒斓男∈蠛腿司又械谋磉_(dá), 結(jié)果表明，Tssk1和Tssk2都表達(dá)于小鼠和人的成熟精子中, 此外, 抗 Tssk1的抗體不但能夠識(shí)別重組小鼠TSSK1, 而且還能識(shí)別重組小鼠的TSSK2, 很可能是兩者具有較高的同源性之故, 這與Li et al (2011)的結(jié)果一致；但是, Tssk2在小鼠中的情況卻與Li et al (2011)的不盡相同, 我們的Western blotting結(jié)果顯示，抗Tssk2抗體既能識(shí)別重組小鼠Tssk2,同時(shí)還能識(shí)別重組小鼠Tssk1, 而Li et al (2011)的報(bào)道中抗Tssk2抗體只能識(shí)別重組小鼠的Tssk2。我們用的抗體與Li et al (2011)所用的完全相同, 不同之處僅在于重組 Tssks蛋白的提取純化方法上, 但這似乎不能解釋產(chǎn)生抗體識(shí)別差異的原因, 具體原因有待進(jìn)一步研究。用同樣的抗體我們?cè)谌司又袡z測(cè)到有Tssk1和Tssk2 的存在,并且, 與小鼠中的情況不同, 這兩種抗體都只識(shí)別一種相應(yīng)的人重組Tssk, 此結(jié)果與Li et al (2011)的報(bào)道完全一致。

在分析了Tssk1和Tssk2 在成熟精子中表達(dá)的基礎(chǔ)上, 我們采用免疫組化方法研究了這兩種蛋白激酶在精子中的分布與定位, 發(fā)現(xiàn) Tssk1存在于小鼠精子頂體及整個(gè)尾部；而Tssk2主要分布于頭部頂體后的區(qū)域, 研究結(jié)果與Li et al (2011)的報(bào)道一致。2009年, Sosnik et al (2009)報(bào)道小鼠精子上受精所必須的Izumo蛋白分子在頂體反應(yīng)中會(huì)發(fā)生遷移,這種遷移是成功受精的先決條件且與Tssk6密切相關(guān), 敲除Tssk6基因的雄性小鼠能產(chǎn)生精子, 但是不能完成正常受精。這說(shuō)明精子中的一些蛋白分子在受精前的關(guān)鍵環(huán)節(jié)中會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化且與受精直接相關(guān), 因此, 我們檢測(cè)了 Tssk1 和 Tssk2在未獲能、獲能及頂體反應(yīng)的小鼠精子中的定位情況, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)它們的分布模式未發(fā)生改變；經(jīng)分析, 人精子中Tssk1和Tssk2的情況也如此(數(shù)據(jù)未顯示)。在射出的人精子中, Tssk1分布于精子的頸部及尾部,Tssk2則分布于赤道板的位置。本研究中Tssk1的分布模式與Li et al (2011)的報(bào)道一致, Tssk2在人精子中的定位卻與其不同, 而和Hao et al (2004)的報(bào)道一致。需要指出的是, 3項(xiàng)研究中用于免疫組化分析的精子其遺傳、生殖力背景都不清楚, 因此, 我們認(rèn)為T(mén)ssk2的這種分布模式差異很可能與精子本身的差異有關(guān), 這是否也從另一個(gè)側(cè)面說(shuō)明 Tssk2的亞細(xì)胞定位與人精子的內(nèi)在特性有關(guān)。果真如此的話, 我們就可以通過(guò) Tssk2的分布模式來(lái)預(yù)測(cè)精子質(zhì)量及其受精能力。

通過(guò)本研究, 我們證明了Tssk1 和Tssk2存在于成熟的小鼠精子和人精子中, 它們?cè)诰又械姆植寄Ｊ讲槐M相同, 由于精子是高度分化、區(qū)域化明顯的特異細(xì)胞, Tssks在精子中的不同空間分布圖示提示Tssk1和Tssk2可能對(duì)精子功能具有重要的調(diào)控作用,而且, 它們的調(diào)控作用及其機(jī)制可能各不相同。本研究結(jié)果顯示, 小鼠和人精子尾部都有Tssk1的存在, 似乎暗示著它與精子的運(yùn)動(dòng)性調(diào)控有關(guān); 除在尾部有分布外, Tssk1還分布于小鼠精子的頂體上, 但這是否說(shuō)明它參與小鼠精子的頂體反應(yīng)還需要做進(jìn)一步的研究。與小鼠精子中的情況稍有不同, 在本研究中僅在人精子頸部和尾部檢出Tssk1的信號(hào), 而Li et al (2011)則報(bào)道像小鼠精子一樣, Tssk1存在于人精子的頭部(頂體)和尾部。因此, 本研究中觀察到不同于小鼠精子的 Tssk1在人精子中的分布模式很可能不是由于物種差異，而是由人精子樣本差異所造成的, 至于這種差異意味著什么則有待探明。與Tssk1的分布截然不同, Tssk2分別位于小鼠精子頭部頂體后區(qū)域和人精子頭部赤道板附近, 據(jù)Sosnik et al (2009)的報(bào)道, 這些區(qū)域聚合肌動(dòng)蛋白較為豐富, 它們與精卵融合與受精直接相關(guān)；他們的研究表明，Tssk6基因敲除的雄鼠因其精子中肌動(dòng)蛋白聚合受阻, 致使精子Izumo蛋白不發(fā)生遷移最終導(dǎo)致精卵融合與受精失敗。有意思的是, 我們發(fā)現(xiàn)在小鼠精子中 Tssk2的分布模式與 Tssk6的分布非常相似。因此, 我們推測(cè), Tssk2很可能也與精子的頂體反應(yīng)有關(guān), 但這需要進(jìn)行深入研究來(lái)證明, 人精子中 Tssk2的作用是否如此也有待研究。

已有的研究表明，TSSKs在動(dòng)物(人)精子發(fā)生和(或)成熟精子功能發(fā)揮中起著重要的調(diào)控作用, 而且,Tssks基因敲除的小鼠除生殖力外, 其他表型都不受影響(Spiridonov et al, 2005; Xu et al,2008b), 對(duì)這類蛋白激酶的深入研究將有助于理解相關(guān)男性不育癥的發(fā)病機(jī)制, 并有望為男性非激素類避孕藥物的研發(fā)提供新思路。由于蛋白激酶已成為新藥研發(fā)的重要標(biāo)靶, 這暗示著可以將TSSKs作為研發(fā)非激素類男性避孕藥物的標(biāo)靶, 例如,TSSKs蛋白激酶的特異性抑制劑便是研發(fā)男用避孕藥物的理想候選物。進(jìn)一步的工作需要進(jìn)行TSSKs蛋白空間結(jié)構(gòu)的解析并抓緊尋找、設(shè)計(jì)TSSKs的抑制劑。

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Cloning and expression of Tssk1 & Tssk2 in mice and the presence & localization of them in mature sperm

YANG Ming-Hua1,#, SU Jin-Zhu1,#, LIU Jun1, LI Ya-Hui1,2,*

(1.College of Animal Science & Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming650201,China;2.College of Food Science & Technology,Yunnan Agricultural University,Kunming650201,China)

We sought to experimentally verify if testis specific serine/threonine kinases (Tssks) play a role in spermatogenesis and/or the regulation of sperm function. Purified Tssk proteins were obtained based on cloning and expression of mouse Tssk1 and Tssk2. Tssk1 and Tssk2 were detected in mature mouse and human sperm by western blotting. Immunofluorescence indicated that Tssk1 is distributed in the acrosome and the entire flagellum of mouse sperm while Tssk2 was mainly distributed in post-acrosomal region. There was no alteration in the distribution pattern of Tssk1 and Tssk2 in non-capacitated and capacitated sperm. Tssk2 distribution remained unchanged after induced acrosome reaction but no signals were detected in the acrosome for Tssk1, which was present before the acrosome reaction, though signals in flagellum were undisturbed. In human sperm, Tssk1 was found in neck and flagellum while Tssk2 was found in the equatorial region. Our results suggest Tssk1 and/or Tssk2 do play an important role(s) in the regulation of sperm function.

Tssk kinases; Testis-specific; Sperm function; Phosphorylation

Q954.434; Q78；Q555

A

0254-5853-(2012)04-0381-08

10.3724/SP.J.1141.2012.04381

2012-02-01；接受日期：2012-05-15

國(guó)家自然科學(xué)基金專項(xiàng)基金(31040055)

?通信作者(Corresponding author)，E-mail: liyh85@yahoo.com.cn#共同第一作者(Authors contributed equally to the work)