胡友德 汪建中

（江西省人民醫(yī)院 南昌330006）

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、儀器和材料

1.1.1 動(dòng)物 8 周齡健康Sprague-Dawley(SD)大鼠96 只，雌雄各半，體重200～280 g，普通級(jí)，由南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)部提供。除A、B 兩組用常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)混合飼料喂養(yǎng)，C、D 兩組用Keyes2000 牙周炎飼料加自身糞便水喂養(yǎng)外，其他喂養(yǎng)條件相同。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 ZP-12P 生物組織自動(dòng)脫水機(jī)，亞光YB-6LF 組織包埋機(jī)，電熱恒溫水浴鍋，LEICA RM2135 組織切片機(jī)，Motic Med 6.0 數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)材料 Keyes2000[6]牙周炎飼料（果糖56%、脫脂奶粉28%、面粉6%、酵母4%、苜宿榆3%、動(dòng)物肝粉1%、食鹽2%、少量蔬菜）南昌大學(xué)動(dòng)物科學(xué)部配制；牙釉質(zhì)粘合樹(shù)脂，天津市合成材料工業(yè)研究所；牙用自攻自斷螺紋釘，杭州西湖生物材料有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 參照隨機(jī)數(shù)字表法將96 只SD大鼠染色后隨機(jī)分為四組，空白對(duì)照組（A 組）、 創(chuàng)傷組（B 組）、牙周炎組（C 組）、創(chuàng)傷與牙周炎復(fù)合組（D 組）。A 組不做任何處理，常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)混合飼料喂養(yǎng)；B 組于左側(cè)上頜第一磨牙面正中植入一自攻自斷螺紋釘并用牙釉質(zhì)粘合樹(shù)脂加固，常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)混合飼料喂養(yǎng)；C 組不做任何處理，用Keyes2000 牙周炎飼料加自身糞便水喂養(yǎng)；D 組處理同B 組，用Keyes2000 牙周炎飼料加自身糞便水喂養(yǎng)。每組24只，雌雄各半，體重200～280 g。

1.2.3 標(biāo)本提取和組織切片的制作 各組分別于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后1、4、8、12 周用脊髓拉斷法處死，每組每次隨機(jī)處死6 只，雌雄各半，處死時(shí)間均選擇為8：00～12：00。處死后分離左側(cè)下頜第一磨牙區(qū)帶牙齦和牙槽骨的組織塊，放入一Eppendorf 管內(nèi)，管壁外編號(hào)標(biāo)記，管內(nèi)加入4%多聚甲醛固定48 h。7%EDTA 4 ℃脫鈣60 d，取出標(biāo)本修整，酒精系列脫水，石蠟整體包埋，重新編號(hào)。包埋方向處于第一磨牙頰舌向；連續(xù)切片，厚度5 μm，HE 染色。以上操作由同一人完成。

1.2.4 觀察結(jié)果與數(shù)據(jù)采集 利用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)低倍下選擇有第一磨牙頰舌向最大切面的切片作為有效切片。仔細(xì)觀察每一張切片上第一磨牙牙齦、牙周膜、牙槽骨的病理變化，記錄每一張切片的觀察結(jié)果。對(duì)牙根牙槽骨表面破骨細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，破骨細(xì)胞指位于鋸齒狀邊緣的破骨陷窩內(nèi)或牙槽骨表面的多核嗜酸性巨細(xì)胞（核多于2 個(gè)）。隨機(jī)選5 個(gè)視野（×400），將所得結(jié)果求平均值。測(cè)量牙槽嵴高度與釉牙骨質(zhì)界到根尖距離的比值，測(cè)量方法是以牙槽嵴頂點(diǎn)在牙根表面的投影到根尖的距離除以釉牙骨質(zhì)界到根尖的距離，分3 次測(cè)量求平均值。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)處理 結(jié)果用SPSS12.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所檢測(cè)的兩個(gè)數(shù)值型指標(biāo)分布呈正態(tài)分布采用(±S)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。同一組內(nèi)4 個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)及同一時(shí)間各實(shí)驗(yàn)組間的指標(biāo)對(duì)比如滿(mǎn)足正態(tài)、方差齊則采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間比較用LSD 法，否則非參數(shù)檢驗(yàn)方法。

2 結(jié)果

2.1 破骨細(xì)胞數(shù) 見(jiàn)表1。組內(nèi)分析：A 組在不同時(shí)間破骨細(xì)胞數(shù)沒(méi)有變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；B 組在第1 周明顯增高，隨后明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=117.222，P ＜0.05）；C、D 兩組隨時(shí)間延長(zhǎng)而明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=153.333，P ＜0.05）。組間分析：第1 周時(shí)，B 組與D 組破骨細(xì)胞數(shù)明顯高于其他兩組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；從第4 周到第12 周，C、D 兩組與A、B 兩組的差異明顯增大，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=230.504，P ＜0.05）；D 組明顯高于C 組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在第12 周時(shí)，A 組與B 組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組不同時(shí)間的破骨細(xì)胞數(shù) (±S) 個(gè)

表1 各組不同時(shí)間的破骨細(xì)胞數(shù) (±S) 個(gè)

組別n第1 周第4 周第8 周第12 周A 組 6 0.167±0.408 0.167±0.408 0.167±0.408 0.167±0.408 B 組 6 6.833±0.753 1.500±0.548 1.167±0.408 0.667±0.817 C 組6 1.167±0.408 4.667±0.817 7.167±0.753 9.000±0.632 D 組 6 6.833±0.753 8.500±0.548 10.667±0.816 12.333±0.516

2.2 牙槽嵴與釉牙骨質(zhì)界到根尖距離的比值 見(jiàn)表2。組內(nèi)分析：A、B 兩組牙槽嵴高度降低不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；C、D 兩組隨時(shí)間延長(zhǎng)而明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=153.333，P ＜0.05）。組間分析：A、B 兩組無(wú)明顯差異，C 組比A、B 兩組降低明顯，而D 組又比C 組降低明顯，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 各組不同時(shí)間的牙槽嵴與釉牙骨質(zhì)界到根尖距離的比值 (±S)

表2 各組不同時(shí)間的牙槽嵴與釉牙骨質(zhì)界到根尖距離的比值 (±S)

組別n第1 周第4 周第8 周第12 周A 組6 0.808±0.008 0.803±0.006 0.797±0.011 0.794±0.006 B 組6 0.802±0.005 0.795±0.011 0.794±0.009 0.792±0.006 C 組6 0.803±0.010 0.722±0.015 0.703±0.006 0.558±0.007 D 組6 0.806±0.007 0.693±0.006 0.563±0.007 0.495±0.008

3 討論

牙周炎動(dòng)物模型建立的方法有很多種。Caillon P[7]等用高糖飼料Keyes2000 喂養(yǎng)地鼠，6 周后，形成實(shí)驗(yàn)性牙周炎。楊新雪[8]報(bào)道以高糖食譜加糞便水飼養(yǎng)大鼠7 周可見(jiàn)牙周炎改變。Kuhr 等用牙頸部絲線(xiàn)結(jié)扎法結(jié)扎大鼠上頜第二磨牙頸部，發(fā)現(xiàn)明顯的骨喪失發(fā)生在最初的15 d 內(nèi)。Chang KM[9]等用接種特異菌法發(fā)現(xiàn)單一注射牙齦卟啉菌口腔接種能夠于6 周后誘導(dǎo)大鼠實(shí)驗(yàn)性牙周炎的發(fā)生。Ichie YM[10]等研究發(fā)現(xiàn)，單一致病菌能夠誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性牙周炎，但多種致病菌的協(xié)同作用可加重病情進(jìn)展的疾病的嚴(yán)重性。Dumitrescu AL[11]等通過(guò)在Wistar 大鼠下頜第二磨牙牙齦內(nèi)單獨(dú)注射脂多糖LPS 10 μg/μL，結(jié)果證明在大鼠齦下注射LPS 可以提供一個(gè)簡(jiǎn)單的、具有可重復(fù)性的而且與人牙周炎特征相似的實(shí)驗(yàn)性牙周炎動(dòng)物模型。以上牙頸部絲線(xiàn)結(jié)扎法、接種特異菌法、注射脂多糖法實(shí)驗(yàn)本身對(duì)實(shí)驗(yàn)牙牙周造成直接創(chuàng)傷，而高糖飼料法對(duì)實(shí)驗(yàn)牙牙周不直接產(chǎn)生破壞，僅表現(xiàn)為創(chuàng)傷。所以，為了盡可能減少實(shí)驗(yàn)本身的干擾，本實(shí)驗(yàn)采用Keyes2000 高糖飼料加糞便水喂養(yǎng)的方法造成牙周炎動(dòng)物模型。

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