王小龍，陳 霞，遲 瑋，褚玉晶，李志媛，李曉眠

(天津醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室，天津 300070)

清咽滴丸為新型主治咽炎中藥合劑，具有疏風(fēng)清熱，解毒利咽，消腫止痛的功效［1］，臨床效果顯著?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，清咽滴丸有很強(qiáng)的抑菌殺菌作用，尤其是對(duì)白色念球菌和金黃色葡萄球菌［2］。柯薩奇病毒B3、B5(Coxsackie virus B3，B5;CVB3，CVB5)已證明是小兒病毒性心肌炎、無(wú)菌性腦炎、新生兒全身感染、流行性胸痛等疾病的主要病原體，目前尚無(wú)特效藥治療或預(yù)防。本試驗(yàn)對(duì)清咽滴丸及其六種成分抗柯薩奇病毒作用進(jìn)行了初步試驗(yàn)研究，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥物 清咽滴丸(天津市中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司第六中藥廠提供);甘草、青黛、冰片、訶子、牛黃、薄荷(天津市中新藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司第六中藥廠提供);病毒靈(山西太原藥業(yè)有限公司生產(chǎn))。

1.1.2 細(xì)胞與病毒株 Vero 細(xì)胞株;柯薩奇B3病毒Nancy 株;柯薩奇B5病毒Kauchker 株(天津醫(yī)科大學(xué)微生物教研室提供)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性健康SD 大鼠18 只，體重均約250 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.4 試劑與耗材 RPMI-1640 培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(Hyclone);四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)(Sigma);二甲基亞砜(天津大學(xué)科威公司);96 孔培養(yǎng)板(Costar)。

1.1.5 儀器與設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Forma，3111 型);倒置顯微鏡(德國(guó)Zeiss，Axiorert 200);酶標(biāo)儀(Multiskan Mk3，Thermo Labsystems)。

1.2 方法

1.2.1 藥物溶解與稀釋 0.8 g 甘草、青黛、訶子、牛黃、病毒靈分別溶解于3.5 ml 1640 培養(yǎng)液后加入0.5 ml DMSO;0.8 g 冰片、薄荷分別溶解于0.5 ml DMSO后加入3.5 ml 1640 培養(yǎng)液。充分溶解后，1 500 r/min離心5 min，棄不溶殘?jiān)?，高壓滅菌。將無(wú)菌的藥液先稀釋10 倍后再做連續(xù)2 倍的遞次稀釋，配制藥液濃度為:2. 0 ×10-2、1. 0 ×10-2、5 ×10-3、2. 5 × 10-3、1.25 ×10-3、6.25 ×10-4、3.125 ×10-4和1.56 ×10-4g/ml。

1.2.2 藥物毒性實(shí)驗(yàn) 將Vero 細(xì)胞接種于96 孔板，100 μl /孔。分別加入上述各種濃度藥物的稀釋液，每個(gè)濃度4 復(fù)孔。另設(shè)正常細(xì)胞對(duì)照組、空白對(duì)照組。每日記錄CPE［3］，72 h 后用MTT 法檢測(cè)細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組平均OD 值-空白對(duì)照組平均OD 值)/(正常細(xì)胞對(duì)照組平均OD 值-空白對(duì)照組平均OD 值)×100%。

1.2.3 病毒滴度TCID50的測(cè)定 將Vero 細(xì)胞接種于96 孔板，將柯薩奇B3、B5病毒連續(xù)10 倍的遞次稀釋，稀釋度為10-1～10-10。每孔接種10 μl 上述系列稀釋度的病毒液，于37 ℃吸附2 h 后換維持液繼續(xù)培養(yǎng)，每個(gè)濃度4 復(fù)孔。每日觀察CPE，待細(xì)胞病變不再繼續(xù)，按Reed-Muench 方法計(jì)算CVB3、CVB5的50%組織感染劑量(TCID50)。

1.2.4 藥物對(duì)病毒的作用 配制藥物無(wú)毒臨界濃度TC0，加入病毒侵染的細(xì)胞中，每藥物4 復(fù)孔。觀察CPE，待病毒對(duì)照孔細(xì)胞病變達(dá)75%以上，記錄各孔的CPE，MTT 法測(cè)病毒抑制率。病毒抑制率=(實(shí)驗(yàn)組平均OD 值-病毒對(duì)照組平均OD 值)/(正常細(xì)胞組平均OD 值-病毒對(duì)照組平均OD 值)×100%。

1.2.5 不同濃度含藥血清對(duì)細(xì)胞毒性作用 取9 只大鼠隨機(jī)分成3 組，每組3 只。將清咽滴丸、甘草、訶子按100 mg/kg 體重的藥量給SD 大鼠灌胃(相當(dāng)于成人臨床推薦劑量的6 倍)［4］，給藥前禁食12 h。給藥后1 h 內(nèi)眥取血，1 500 r/min 離心20 min，無(wú)菌分離血清，56 ℃水浴30 min 滅活［5］。將9 組含藥血清稀釋1∶ 2、1∶ 4、1∶ 6、1∶ 10、1∶ 16，100 μl/孔加到Vero 細(xì)胞中，每濃度4 復(fù)孔。每日觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，48 h后用MTT 法測(cè)細(xì)胞存活情況。

1.2.6 不同時(shí)間含藥血清對(duì)病毒的抑制作用 取9只大鼠隨機(jī)分成3 組，每組3 只。將清咽滴丸、甘草、訶子按100 mg/kg 體重的藥量給SD 大鼠灌胃(相當(dāng)于成人臨床推薦劑量的6 倍)，給藥前禁食12 h。灌胃前第1 次內(nèi)眥取血，灌胃25 min 之后，第2 次取血，以后每隔20 min 取血1 次，每次取血約1.5 ml。總共采血6 次。無(wú)菌分離血清之后，將9 組血清按100 μl/孔加入到被病毒感染的單層Vero 細(xì)胞中，每組設(shè)4 復(fù)孔，每日記錄CPE。48 h 后用MTT 法測(cè)細(xì)胞存活情況。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 11.5 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA 單因素方差分析，各組間兩兩比較采用Dunnett 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 清咽滴丸及其六種成分對(duì)細(xì)胞毒性作用 薄荷對(duì)細(xì)胞的毒性表現(xiàn)在使細(xì)胞先變細(xì)長(zhǎng)呈梭形，繼而變小變圓。清咽滴丸、甘草、青黛、訶子、牛黃、冰片、病毒靈直接使細(xì)胞變小變圓。高濃度時(shí)細(xì)胞固縮破碎死亡量增大明顯。各藥物無(wú)毒臨界濃度(TC0):甘草為2.5 ×10-3g/ml，青黛為3. 125 × 10-4g/ml，冰片為2.5 ×10-3g/ml，牛黃為1. 56 × 10-4g/ml，訶子為3.125 ×10-4g/ml，薄荷為6.25 ×10-4g/ml，病毒靈為6.25 ×10-4g/ml。

2.2病毒滴度CVB3:TCID50= 10-7.6，CVB5:TCID50=10-7.2

2.3 藥物對(duì)病毒的作用 病毒對(duì)照組CPE 現(xiàn)象明顯，清咽滴丸、甘草、訶子組細(xì)胞病變明顯減弱，說(shuō)明清咽滴丸、甘草、訶子對(duì)CVB3、CVB5感染的細(xì)胞有治療作用。其他組CPE 達(dá)75%以上，說(shuō)明其他藥物無(wú)效。在CVB3感染的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，清咽滴丸組與病毒靈對(duì)照組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，甘草組與病毒靈對(duì)照組差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，說(shuō)明清咽滴丸、甘草對(duì)CVB3感染的細(xì)胞治療效果優(yōu)于病毒靈。訶子組與病毒靈對(duì)照組差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05)，說(shuō)明訶子對(duì)CVB3感染的細(xì)胞治療效果不優(yōu)于病毒靈。在CVB5感染的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，清咽滴丸組、甘草組、訶子組與病毒靈對(duì)照組差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)，說(shuō)明清咽滴丸、甘草、訶子對(duì)CVB5感染的細(xì)胞治療效果優(yōu)于病毒靈。見(jiàn)表1。

表1 不同藥物對(duì)CVB3 和CVB5 的OD 值和抑制率

2.4 不同濃度含藥血清對(duì)細(xì)胞毒性作用 稀釋度為1∶ 10含清咽滴丸血清組、1∶ 10含甘草血清組、1 ∶ 6含訶子血清組均與病毒對(duì)照組CPE 有明顯差別，表現(xiàn)為對(duì)細(xì)胞的保護(hù)作用，且此時(shí)血清的毒性作用小。

2.5 不同時(shí)間含藥血清對(duì)病毒的抑制作用 將含藥血清分別對(duì)CVB3和CVB5的抑制率繪制成時(shí)間-效應(yīng)曲線，提示含藥血清對(duì)CVB3、CVB5的抑制作用具有明顯的時(shí)間依賴性，即清咽滴丸在65 min 時(shí)對(duì)CVB3，在65 min 至105 min 對(duì)CVB5有明顯抑制作用。而甘草在65 min 時(shí)，訶子在85 min 時(shí)分別對(duì)CVB3有明顯抑制作用。甘草在65 min，訶子在85min 時(shí)對(duì)CVB5有抑制作用但效果并不明顯見(jiàn)圖1 -3。

圖1 不同時(shí)刻含清咽滴丸血清對(duì)CVB3 和CVB5 的抑制率

圖2 不同時(shí)刻含甘草血清對(duì)CVB3 和CVB5 的抑制率

圖3 不同時(shí)刻含訶子血清對(duì)CVB3 和CVB5 的抑制率

3 討論

柯薩奇病毒B3、B5是正鏈RNA 病毒，主要通過(guò)糞-口途徑傳播，也可通過(guò)呼吸道或眼部黏膜感染。研究發(fā)現(xiàn)，約50%病毒性心肌炎系CVB3所致［6］。CVB5可以引起病毒性肝炎，持續(xù)感染可誘發(fā)肝硬化、肝癌。藥理學(xué)研究表明，清咽滴丸具有抗菌的作用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)甘草具有腎上腺皮質(zhì)激素作用，可抗病毒、消炎、抗變態(tài)反應(yīng)?？共《镜闹饕钚猿煞譃楦什萏鹚睾透什荻嗵?，既可直接清除病毒顆粒，又可誘生干擾素，增加自然殺傷細(xì)胞活性，從而使組織細(xì)胞得到保護(hù)。訶子果實(shí)水煎液有殺菌效用［7］。

在實(shí)驗(yàn)研究中，采用了血清藥理學(xué)方法［8］，因?yàn)橹兴幋种苿┖写罅康碾s質(zhì)，如直接應(yīng)用它進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)，這些雜質(zhì)會(huì)干擾實(shí)驗(yàn)過(guò)程，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性。因此，目前中藥藥理學(xué)研究中，有相當(dāng)一部分中藥藥理活性實(shí)驗(yàn)和作用機(jī)理研究是用血清藥理學(xué)進(jìn)行的。同時(shí)，也應(yīng)該看到，血清藥理學(xué)作為一種年輕的實(shí)驗(yàn)研究方法還不夠完善，存在著許多尚待解決的問(wèn)題，如目前由于血清中有效成分的定量分析檢測(cè)尚未有突破性進(jìn)展，因此還沒(méi)有關(guān)于不同狀態(tài)血清中有效成分的藥代動(dòng)力學(xué)的研究比較。

本實(shí)驗(yàn)提示了甘草和訶子是清咽滴丸抗CVB3、CVB5的有效成分，為甘草和訶子作為抗病毒感染藥物進(jìn)行進(jìn)一步開(kāi)發(fā)研究提供了科學(xué)的理論依據(jù)，但甘草和訶子抗病毒的機(jī)制不明，有待更加深入的研究，其成分還需通過(guò)化學(xué)分析進(jìn)一步明確其單體構(gòu)成，其抗CVB3、CVB5的作用還需要在動(dòng)物體內(nèi)試驗(yàn)上進(jìn)一步加以證實(shí)。

1 詹可順，魏偉，余南生.清咽滴丸治療慢性咽炎的臨床研究.中國(guó)基層醫(yī)藥，2003，10(11):1129

2 齊偉，郭長(zhǎng)源.中藥清咽滴丸的研制和療效觀察. 華夏醫(yī)藥，2006，1(2):110

3 王亞峰，張美英，郝靜，等.苦丁茶水提物體外抗柯薩奇病毒B3活性的實(shí)驗(yàn)研究.中華中醫(yī)藥雜志，2008，23(11):976

4 章元沛. 藥理學(xué)實(shí)驗(yàn). 第2 版. 北京:人民衛(wèi)生出版社，1996:238 -238

5 劉成海，劉平，劉成，等.抗肝纖維化有效中藥復(fù)方血清藥理學(xué)方法探討.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，1998，4(2):16

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7 蔡小華，謝兵，杜海軍.訶子化學(xué)成分及藥理作用的研究進(jìn)展.藥學(xué)進(jìn)展，2008，32(5):212

8 崔曉蘭，賀玉琢，高英杰，等.中藥復(fù)方血清藥理研究方法學(xué)探討. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)，1998，4(2):13