嚴(yán) 紅，張 妍，高丹丹

(天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193)

腎消顆粒由黃芪、丹參、淫羊藿、五味子等8味中藥組成，用于脾腎兩虛型糖尿病腎病及各種腎臟病變引起的蛋白尿，浮腫，腰膝酸痛，尿頻或混濁，陽(yáng)痿遺精，臨床效果滿意。為有效控制制劑的內(nèi)在質(zhì)量，完善并提高原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本文改進(jìn)了腎消顆粒中黃芪、淫羊藿的TLC鑒別方法，采用高效液相色譜法測(cè)定了淫羊藿中淫羊藿苷和丹參中丹參素鈉、原兒茶醛的含量。結(jié)果方法準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于腎消顆粒的質(zhì)量控制。制劑質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的提高，對(duì)于保證藥物的臨床療效必將產(chǎn)生重要意義。

1 儀器與試藥

貝克曼高效液相色譜儀:125高壓輸液泵，168二極管陣列檢測(cè)器，Gold Chromatograhy Data System數(shù)據(jù)工作站。甲醇、乙腈為色譜純;其他試劑為分析純;水為純化水。丹參素鈉對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110855－200508)，原兒茶醛對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110810－200506)，淫羊藿苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào) 110737－200413)，黃芪甲苷對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)11078－1200613)(“2.1”項(xiàng)下使用的對(duì)照品)。腎消顆粒(本院制劑室提供，批號(hào) 080505、080704、080924)。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芪和淫羊藿的TLC鑒別 取本品2 g，研細(xì)，加水飽和正丁醇25 ml，超聲提取30 min，濾過(guò)，濾液用氨試液10 ml提取1次，棄去氨試液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。取缺淫羊藿的陰性對(duì)照和缺黃芪的陰性對(duì)照樣品同法制備陰性對(duì)照液。另取黃芪甲苷、淫羊藿苷對(duì)照品，分別加甲醇制成每1 ml含黃芪甲苷1 mg、淫羊藿苷0.5 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取供試品溶液、陰性對(duì)照液各4 μl、對(duì)照品溶液各2 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠 G 薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水(13∶6∶2)5～10℃放置過(guò)夜的下層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，而陰性對(duì)照無(wú)此斑點(diǎn)。結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 黃芪和淫羊藿的TLC鑒別圖

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Irregular－H C18柱(250 mm ×4.6 mm，10 μm);丹參素鈉、原兒茶醛流動(dòng)相:甲醇－1%醋酸溶液(2∶98);流速:1.0 ml/min，進(jìn)樣量:20 μl;檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm;柱溫:29℃;理論板數(shù)按丹參素鈉峰計(jì)算不低于5 000。淫羊藿苷流動(dòng)相:乙腈－水(30∶70);流速:1.0 ml/min，進(jìn)樣量:20 μl;檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm;理論板數(shù)按淫羊藿苷峰計(jì)算不低于3 000。

2.2.2 溶液液備

2.2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 取丹參素鈉、原兒茶醛對(duì)照品適量，精密稱定，加過(guò)膜50%甲醇制成每1 ml含丹參素鈉300 μg(相當(dāng)于丹參素270 μg)、原兒茶醛24 μg的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取丹參素鈉、原兒茶醛混合儲(chǔ)備液5 ml于50 ml量瓶中，加過(guò)膜50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。取淫羊藿苷對(duì)照品適量，精密稱定，加過(guò)膜甲醇制成每1 ml含淫羊藿苷116 μg的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密吸取淫羊藿苷儲(chǔ)備液2 ml于10 ml量瓶中，加過(guò)膜甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.2.2.2 供試品溶液的制備 取本品研細(xì)過(guò)3號(hào)篩，取1 g，精密稱定，置100 ml具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲30 min，取出，放冷，稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，過(guò)0.45 μm濾膜，取續(xù)濾液，即得丹參素鈉、原兒茶醛供試品溶液。取本品研細(xì)過(guò)3號(hào)篩，取1 g，精密稱定，置100 ml具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 m l，密塞，稱定重量，超聲45 min，取出，放冷，稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，精密吸取續(xù)濾液20 ml，水浴蒸干，殘?jiān)铀? ml微熱溶解，加于預(yù)先處理好的D101型大孔吸附樹脂柱(柱內(nèi)徑為1.5 cm，柱高10 cm)，吸附 0.5 h，以水、30%乙醇各 50 ml洗脫，棄去，再用70%乙醇洗脫，收集70%乙醇洗脫液60 ml，水浴蒸干，殘?jiān)?0%乙醇溶解并轉(zhuǎn)移置10 ml量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，過(guò)0.45 μm 濾膜，取續(xù)濾液，即得淫羊藿苷供試品溶液。

2.2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按處方取除丹參的各味藥材，按制備工藝制成顆粒，按供試品溶液制法制備丹參陰性對(duì)照溶液。按處方取除淫羊藿的各味藥材，按制備工藝制成顆粒，按供試品溶液制法制備淫羊藿陰性對(duì)照溶液。分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液20 μl注入液相色譜儀，結(jié)果表明陰性對(duì)照溶液無(wú)干擾，見(jiàn)圖2和圖3。

2.2.3 線性關(guān)系的考察 精密吸取丹參素鈉－原兒茶醛的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液 0.25、1、2、3 和 4 ml，置 10 ml量瓶中，加過(guò)膜50%甲醇稀釋至刻度;精密吸取上述5種濃度的對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，按相應(yīng)色譜條件分析，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品溶液濃度(mg/ml)為縱坐標(biāo)，峰面積值為橫坐標(biāo)，求得丹參素鈉回歸方程:Y=8.577 E －008 X(r=0.999 9)。表明在 0.15 ～2.40 μg范圍內(nèi)線性良好。原兒茶醛回歸方程:Y=1.288 E －008 X+1.4 E －004(r=0.999 9)。結(jié)果表明在0.012 ～0.192 μg范圍內(nèi)線性良好。

精密吸取淫羊藿苷對(duì)照品儲(chǔ)備液 0.5、1、2、3、4 和5 ml，置10 ml量瓶中，加過(guò)膜甲醇稀釋至刻度。精密吸取上述6種濃度的對(duì)照品溶液注入液相色譜儀，按相應(yīng)色譜條件分析，測(cè)定峰面積，以對(duì)照品溶液濃度(mg/ml)為縱坐標(biāo)，峰面積值為橫坐標(biāo)，淫羊藿苷回歸方程:Y=6.307 E －008 X(r=0.999 9)。表明在0.058 ～0.580 μg 范圍內(nèi)線性良好。

圖2 對(duì)照品(A)供試品(B)陰性對(duì)照(C)HPLC色譜圖

圖3 對(duì)照品(A)供試品(B)陰性對(duì)照(C)HPLC色譜圖

2.2.4 精密度試驗(yàn) 取一份供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定樣品中丹參素鈉峰面積RSD為0.86%;原兒茶醛峰面積RSD為1.43%;淫羊藿苷峰面積RSD為1.66%。

2.2.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批樣品研細(xì)過(guò)3號(hào)篩，按“2.2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，進(jìn)樣分析，測(cè)得樣品中丹參素鈉平均含量為1.23 mg/g，RSD 為 1.95%;原兒茶醛平均含量為 0.108 mg/g，RSD 為 2.72%;淫羊藿苷平均含量為 0.358 mg/g，RSD 為 2.08%。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0、2、4、6、8和24 h測(cè)定，測(cè)得丹參素鈉和原兒茶醛峰面積值的RSD為1.04%和1.70%，測(cè)得淫羊藿苷峰面積值的RSD為1.72%，表明腎消顆粒供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 回收率試驗(yàn) 取已知含量的樣品(丹參素鈉含量為 1.23 mg/g、原兒茶醛含量為 0.108 mg/g)約0.5 g，6份，精密稱定，分別精密加入丹參素鈉－原兒茶醛混合對(duì)照品儲(chǔ)備液2 ml，按供試品溶液制備方法操作，進(jìn)樣分析;取已知含量的樣品(淫羊藿苷含量為0.358 mg/g)約 0.5 g，6 份，精密稱定，分別精密加入淫羊藿苷對(duì)照品儲(chǔ)備液1.5 ml，按供試品溶液制備方法操作，進(jìn)樣分析。結(jié)果丹參素鈉、原兒茶醛、淫羊藿苷回收率分別為100.3%、99.0%和96.1%，RSD 分別為 2.23%、2.23%和 1.89%。結(jié)果見(jiàn)表 1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

2.2.8 樣品測(cè)定 取3批樣品，按供試品溶液制備操作，按上述色譜條件分別測(cè)定樣品中丹參素鈉、原兒茶醛、淫羊藿苷含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

3 討論

本試驗(yàn)以正丁醇直接提取樣品制備TLC鑒別用供試品溶液，簡(jiǎn)化了原標(biāo)準(zhǔn)中甲醇提取，甲醇液蒸干水轉(zhuǎn)溶，正丁醇萃取的操作，TLC斑點(diǎn)清晰，重現(xiàn)性好。本實(shí)驗(yàn)在一個(gè)展開(kāi)系統(tǒng)同時(shí)鑒別黃芪和淫羊藿，方法簡(jiǎn)便，專屬性強(qiáng)。

曾對(duì)丹參流動(dòng)相及柱溫進(jìn)行考察，結(jié)果甲醇－1%醋酸(2∶98)且柱溫為29℃時(shí)重現(xiàn)性和分離度較好，能同時(shí)測(cè)定丹參素鈉和原兒茶醛。

分別以甲醇、50% 甲醇、稀乙醇、70% 乙醇［1－3］超聲提取樣品，測(cè)定淫羊藿苷含量，結(jié)果，70%乙醇提取液淫羊藿苷含量最高。但提取液的雜質(zhì)峰很高，淫羊藿苷色譜峰相對(duì)于雜質(zhì)峰主峰很小。試驗(yàn)中進(jìn)一步對(duì)提取液分別采用正丁醇萃取法、乙酸乙酯萃取法［4］、D101大孔吸附樹脂乙醇梯度洗脫法［5］凈化樣品，測(cè)定淫羊藿苷含量，結(jié)果，正丁醇萃取法雜質(zhì)峰未見(jiàn)明顯改善，進(jìn)一步以氨試液洗除雜質(zhì)的同時(shí)淫羊藿苷損失大;乙酸乙酯萃取法和D101大孔吸附樹脂吸附法雜質(zhì)峰明顯降低，淫羊藿苷出峰明顯可見(jiàn)，分離好，二者所得淫羊藿苷含量無(wú)明顯差別。考慮方法的簡(jiǎn)便、可操作性及試劑的環(huán)保，選擇柱層析法，方法學(xué)驗(yàn)證表明準(zhǔn)確可靠，可作為測(cè)定本品主藥淫羊藿中淫羊藿苷的含量測(cè)定方法。

1 安軍永，劉敏彥，王玉峰.高效液相色譜法測(cè)定仙靈骨葆顆粒中淫羊藿苷的含量.河北中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2008，23(1):41

2 程朝輝，霍榮昌，李瑾翡.乳增寧片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究.中成藥，2008，30(4):附11

3 中國(guó)藥典.一部.2010:839

4 王海濤，張會(huì)宗.補(bǔ)腎健骨顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，10(4):135

5 付艷麗，徐忠亮，李源君.淫羊藿總黃酮的大孔樹脂精制工藝研究.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)刊，2008，10(4):636