侯 棟，李 曄，王 洋，潘玉雷，崔 同

河北農業(yè)大學食品科技學院，保定071000

原花青素(proanthocyanidins，簡稱PC)是一種能在酸性條件下加熱分解產生花色素的縮合多酚類次生代謝產物，存在于山楂、葡萄、松樹、高粱、蘋果、紅景天、可可、白樺等多種藥用、食用植物組織中。大量研究表明，PC 是一種性能優(yōu)異的天然抗氧化劑和自由基清除劑［1，2］，具有保護心腦血管、抗炎、抗輻射、降低癌癥風險等一系列重要生理作用，是一種重要的天然產物資源。

PC 常以黃烷-3-醇類為主要結構單元，通過4→8 位或4→6 位連接，聚合成十分復雜的混合物，不同植物來源、鍵合方式、聚合程度、加工提取方法等因素都會影響PC 產品的組成和含量，從而影響產品的保健功效。因此，如何準確客觀地表征和分析PC 的組成和含量，一直是制約PC 產業(yè)標準化的重要問題。

目前PC 行業(yè)使用最廣泛的分析方法是分光光度法，如香草醛-鹽酸法［3］、Bate-Smith 法［4］、Porter法［5］等。這些方法包括目前國標方法的缺陷在于，以某種指定對照品進行的分析，其結果不能準確反映不同來源PC 含量的真實差異。HPLC 法［6］包括液譜-質譜聯用法(LC-MS)［7］雖然能對PC 的主要成分直接進行分離和定量分析，但由于PC 組成十分復雜，目前除幾種小分子PC 成分之外，其余PC 純品很難從市場上獲得，并且HPLC 法也很難對所有PC 成分實現徹底分離。

Thompson 等［8］曾發(fā)現，在有親核試劑例如芐硫醇存在下，PC 可在酸性條件下熱分解，基部單元生成相應的黃烷醇分子，上部的其余單元生成相應的芐硫醚衍生物。這便可以使組成十分復雜的PC 混合物經硫解反應后只生成有限幾種反應產物。通過分析這些產物的含量不僅可以獲得樣品中PC 總含量的結果，而且可以通過芐硫醚衍生物總含量與黃烷醇含量的比例關系，計算出樣品中PC 成分的平均聚合度。目前這種方法多應用于PC 成分的結構鑒定，以及一些初步的HPLC 定量分析法［9］。本項研究擬在此基礎上，通過制備和純化PC 的芐硫醚衍生物，并以此為對照品，通過優(yōu)化色譜條件，開發(fā)一種新型的硫解-HPLC 快速分析方法，以便實現PC含量和平均聚合度的同時檢測，為PC 類植物提取物的產品質量評價提供更可靠的分析手段。

1 材料與方法

1.1 儀器

定量分析用HPLC:Agilent 1200 型(安捷倫公司，美國加州帕羅阿托市)，由在線脫氣機，低壓梯度四元輸液泵，Agilent Chemstation 色譜工作站，光電二極管陣列檢測器，CO-3010 柱恒溫控制箱(天津美瑞泰克科技有限公司生產)，及Hypersil BDS C18(100 mm × 2.1 mm i.d.，3 μm)色譜柱組成。

制備HPLC(大連依利特科學儀器有限公司，大連):由P260 型輸液泵，紫外-可見檢測器，Echrom 2000 色譜工作站組成，配用SinoChrom ODS-BP C18(20.0 mm × 300 mm id，10 μm )以及SinoChrom SiO2(20.0 ×250 mm id，10 μm)制備色譜柱。

LC-MS 系統:LTQ 型，美國賽默飛世爾(Thermo Fisher)科技有限公司生產。

1.2 材料

葡萄籽提取物(標示含量＞95%)，陜西中鑫生物技術有限公司生產。山楂，2011 年6 月23 日采自河北農業(yè)大學標本園。

1.3 試劑

沒食子酸(gallic acid，簡稱GA)，表兒茶素(epicatechin，簡稱EC)，兒茶素(catechin，簡稱CT)購于Sigma 公司。芐硫醇購于Fluka(Buchs，Switzerland)公司;表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate，簡稱ECG)購于上海同田生物科技有限公司。色譜級甲醇和乙腈購于Honeywell Burdick ＆ Jackson 公司。表兒茶素-4-苯甲硫醚(EC-S)和表兒茶素沒食子酸酯-4-苯甲硫醚(ECG-S)按下列方法制備:取葡萄籽提取物2 g 溶解于3 mL 甲醇，吸取500 μL 上清液，加入500 μL 含30%芐硫醇的乙醇溶液和250 μL 冰乙酸:1M 鹽酸(50:1，v/v)溶液混合，密封后在90℃反應60 min。然后將硫解產物混合液用反相制備HPLC 反復進樣分離純化，色譜柱為SinoChrom ODS-BP C18(300 mm×20 mm id，10 μm )，流動相為70%甲醇(含0.05%甲酸)，流速10 mL/min，在280 nm 波長下檢測流出物，收集目標餾分于40 ℃減壓濃縮除去甲醇，再用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮。然后用SinoChrom SiO2(250 ×20 mm id，10 μm)正相柱純化，流動相:乙酸乙酯∶石油醚(60∶40，v/v)，流速10 mL/min，檢測波長280 nm，收集目標餾分濃縮至干，最后得到兩種硫醚衍生物純品。經LC-MC 分析，其質譜信息與EC-S 和ECG-S 的結構吻合(見圖2)，其色譜保留行為與文獻報道一致。其余試劑為分析純。

1.4 樣品前處理

取山楂青果，去籽去梗后切碎混勻，精確稱取5 g 至研缽，加入20 mL 95%乙醇溶液(含0.2% Vc，0.2%磷酸)后研磨至粥狀，轉移至50 mL 容量瓶中，超聲提取10 min，用70% 乙醇(含0. 2% Vc，0.2%磷酸)定容至50 mL，混勻、靜置后離心(4000 rpm，10 min)，取上清液過0.45 μm 微孔濾膜，備用。

葡萄籽提取物混勻后精確稱取10 mg，用95%乙醇溶解定容至10 mL，取1 mL 液體用0.45 μm 微孔濾膜過濾，備用。

1.5 硫解反應

反應A 液:5%(v/v)芐硫醇乙醇溶液;反應B液:冰醋酸∶1M 鹽酸(50∶1 v/v)。取100 μL A 液，50 μL B 液，100 μL 樣品溶液，放入小瓶中密封，90℃下水浴反應60 min 后立即冷卻，用于HPLC 分析。

1.6 HPLC 色譜條件

流動相A:0.05%甲酸水溶液;流動相B:乙腈∶甲醇(2∶1，v/v);梯度洗脫程序(min/B%):0/6%，4/50%;6/55%;7/100%;8/100%;9/6%;15/6%;柱溫:35 ℃;流速:0.2 mL/min;進樣量:1 μL;檢測波長:280 nm;定量:峰面積外標法。

1.7 質譜條件

正離子掃描(ESI，m/z 50～1000);毛細管電壓:33 V;光電倍增器電壓:-1560 V;補償電壓:95 V;離子源溫度:35 ℃;不分流檢測。

2 結果與討論

2.1 硫醚衍生物對照品的LC-MS 分析

采用1.6 和1.7 所述的LC-MS 方法對這兩種硫醚衍生物進行了陽離子模式分析，圖1 示這兩種成分的陽離子質譜圖。

圖1 兩種硫解產物正離子模式質譜圖Fig.1 Mass spectrums of two Thiolysis Derivatives

圖1 中(A)給出了質荷比413 的質譜峰，與ECS 的分子離子［M + H］+一致，質核比289 的質譜峰與EC 碎片離子［M–C7H8S］+一致。因此，質譜分析結果支持其結構為EC-S 的判斷。同理，(B)圖給出了質核比為565 的質譜峰，它與ECG-S 的分子離子［M + H］+一致，而質核比為441 的質譜峰與ECG-S 分子去掉硫醚后的ECG 碎片離子［M –C7H8S］+的質量一致，質譜分析結果支持其結構為ECG-S 的判斷。

2.2 對照品貯備液的配制

分別準確稱取對照品GA、CT、EC、ECG、EC-S和ECG-S，用甲醇配制成2 mg/mL 的貯備液，使用前取貯備液用50%甲醇配制相應濃度的混合對照品溶液。

2.3 方法精密度

取2.2 所述對照品貯備液配制混標液，使其中GA、CT、EC、ECG、EC-S 和ECG-S 的濃度分別為160、480、320、160、480 和320 μg/mL，用50%甲醇稀釋1 倍后按1.6 所述HPLC 方法重復進樣5 次，測定峰面積，以評價方法的精密度。計算得6 種對照品峰面積RSD 分別為1.37%、1.09%、1.60%、0.74%、1.85%和1.86%。結果表明，該方法精密度良好。

2.4 線性關系與檢出限

將混合對照品溶液用50% 甲醇逐級稀釋，按1.6 所述HPLC 方法進樣分析，測定峰面積，以峰面積(mAU·S)為縱坐標，以其進樣量(ng)為橫坐標，繪制標準曲線，并以3 倍信噪比(S/N)時的進樣量確定最低檢出限。求得6 種對照品的線性回歸方程、線性回歸系數、最低檢出限，結果見表1。結果表明，響應值與進樣量之間具有良好線性相關性，線性范圍至少320 倍，最低檢出限在ng 數量級，可以滿足常規(guī)樣品的定量分析。

表1 對照品的回歸方程、相關系數、線性范圍及最低檢出限Table 1 Regression equation，correlation coefficient，linear range and the minimum detection limit

2.5 加標回收率分析

采用加標回收率法對方法的準確度進行了評估。重復精確稱取葡萄籽提取物樣品40 mg，溶于10 mL 甲醇溶液中，按照1.5 所述的硫解衍生反應進行處理，再按1.6 所述的方法逐個進樣分析，統計各成分的分析結果，計算各成分含量的平均值。然后另取5 份樣品，每份中均添加含有GA、CT、EC、ECG 的混合對照品，四種成分的加標水平分別為5，65，20 和10 mg/g(干重)。按照1.5 所述的硫解衍生反應進行處理，再按1.6 所述的方法逐個進樣分析，統計各成分的分析結果，計算各成分的加標回收率及其RSD 值，結果見表2。由表中可以看出，CT、EC、ECG 的回收率較高，而GA 的平均回收率偏低，推測GA 比較活潑，在衍生反應過程中存在某種影響因素。

表2 各成分回收率Table 2 Recoveries of gallic acid，catechin，epicatechin and epicatechin gallate

2.6 樣品分析

將混合對照品液按1.6 所述方法進樣HPLC 分析，實際樣品按1.4 所述方法進行樣品前處理，按1.5 所述方法進行硫解并按1. 6 所述方法進行HPLC 分析，典型的色譜圖如圖2 所示。從圖2(A)可以看出，6 種對照品可在11 min 以內完成分離，比以往的方法更快捷。從圖2(B)圖2(C)中可以看出，葡萄籽提取物和山楂樣品經過硫解反應之后色譜圖變得非常簡單，除本試驗選用的6 種主要對照品之外，其它只在8 min 和10 min 之間有3 個含量不高的未知成分，而原來聚集在6～10 min 處的高分子聚合物雜質的大峰已基本消除，這使得PC 的定量分析結果變得更加準確可靠，不同植物來源的PC 之間的比較也變得更加簡單可信。結果表明，不同植物來源的PC，其單體組成差異很大，例如山楂果實的PC 中不含GA、CT 和ECG，因此圖譜顯得更加簡單。

圖2 對照品(A)、山楂硫解樣品(B)及葡萄籽提取物硫解樣品(C)的HPLC 圖Fig.2 HPLC profiles (detected at 280 nm)of reference standards (A)，HPLC traces of polymeric proanthocyanidins from immature Chinese hawthorn (B)after thiolysis and HPLC traces of polymeric proanthocyanidins from grape seed extracts after thiolysis (C)including gallic acid，flavan-3-oL and their relational thiolysis derivatives

兩份實際樣品經過硫解-HPLC 分析，代入相應的標準曲線求得結果如表3。從表3 可以看出，山楂青果中其PC 含量很高，為38.42 mg/g。葡萄籽提取物中PC 含量為427.2 mg/g。

2.7 平均聚合度的計算

根據PC 硫解反應原理［8］可知，樣品經過硫解反應后，其末端生成黃烷醇單體，而上部的其余各單元均生成相應的芐硫醚衍生物。因此，以GA、CA、EC、ECG、EC-S、ECG-S 這些化合物為對照品，可以對樣品中所含原花色素總量進行測定。樣品中PC的平均聚合程度(mDP)則可以由硫解反應液中生成的所有黃烷醇單體的總濃度除以所生成的末端黃烷醇單元濃度之比來計算。即:按以下公式計算:

表3 實際樣品PC 含量(mg/g)Table 3 Contents of PC constitutes in two tested samples

(1)式中:

CCA——兒茶素的摩爾濃度;

CEC——表兒茶素的摩爾濃度;

CECG——表兒茶素沒食子酸酯的摩爾濃度;

CEC-S——表兒茶素芐硫醚衍生物的摩爾濃度;

CECG-S——表兒茶素沒食子酸酯芐硫醚衍生物的摩爾濃度。

由表3 的分析結果計算得出各成分的摩爾濃度，帶入式(1)即可求出樣品中PC 的平均聚合度。山楂青果和葡萄籽提取物的平均聚合度分別為2.97 和4.83。有研究結果表明，只有PC 單體和二聚體能夠被人體小腸的細胞吸收，而三聚體以上的聚合PC 一般不能被人體直接吸收，因此，PC 的平均聚合度是評價PC 質量的一個重要指標。

3 結論

研究結果表明，采用本研究的芐硫醇酸解條件可以使樣品中的聚合PC 分子降解為黃烷醇單體或相應的硫醚衍生物，再用HPLC 法實現了6 種硫解產物在11 min 內的快速分離，15 min 完成一次樣品分析，方法具有良好的靈敏度、精密度和準確度。這種方法的另一個優(yōu)點是，在提供PC 總含量結果的同時還能給出樣品中PC 成分平均聚合度的重要信息，為PC 產品質量評價提供了新的分析手段。本項研究的另一個特點是制備純化了兩種黃烷醇的硫醚衍生物并以此作為HPLC 分析的外標對照品。本方法與以往的分光光度法原理不同，兩者的分析結果可能會有差異，這方面還需要開展大量的分析驗證研究。

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