郭春梅，孫明忠，鄭體花，任一鑫，劉淑清*

1大連醫(yī)科大學生物技術系;2大連醫(yī)科大學生物化學與分子生物學教研室;3大連醫(yī)科大學寄生蟲教研室，大連116044

蛇毒(snake venom，SV)具有抗凝止血、鎮(zhèn)痛、影響血小板聚集、誘導出血或溶血、誘導細胞凋亡、刺激水腫形成、抗病毒、抗腫瘤、抗菌消炎、抗HIV 等多種生物學活性［1-10］，具有很好的臨床應用前景和開發(fā)價值。蛇毒中主要的活性及毒性成分是蛋白(酶)，獲得蛇毒蛋白進行功能研究尤為重要。

中國蛇島蝮蛇(Gloydius shedaoensis shedaoensis，GSS)是我國獨有珍稀蛇種，為國家二級保護物種。蛇毒價格昂貴且來源稀少，而且過度采集蛇毒會嚴重影響GSS 的生存;蛇毒中的大多活性蛋白(酶)含量都很低，采用傳統(tǒng)純化方法很難得到足夠量的目的活性蛋白(酶)［3，4，11］，阻礙了GSS 蛇毒活性蛋白(酶)的開發(fā)利用。從相應cDNA 文庫中篩選cDNA克隆進行表達序列標簽(EST)分析，采用基因工程手段大量表達和獲得蛇毒目的活性蛋白(酶)進行深入研究是一種可行的方法。

EST 是通過隨機選取cDNA 克隆進行單向測序獲取的特定組織在特定時期表達基因的一段序列。EST 是基因的“窗口”，可特異性地代表生物體某組織某一時間的一個表達基因，故被稱為基因表達序列標簽。對生物進行大規(guī)模cDNA 測序不僅可以獲得已知的有重要價值的基因，還可以發(fā)現(xiàn)許多新的未知基因。EST 分析可以用于尋找功能基因、分離與鑒定新基因、基因表達譜研究、構建遺傳圖譜、物理圖譜等［12-18］。

本研究在我們前期成功構建的GSSG-cDNA 文庫基礎上，對211 個ESTs 進行了測序和功能分析，發(fā)現(xiàn)84 個克隆為已知功能基因，29 個克隆為未知功能基因，98 個克隆為新基因，從而為進一步對GSS 活性蛋白基因的克隆、表達和功能研究奠定了一定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

GSSG-cDNA 文庫由本實驗室制備并保存;DNA Marker、Rnase A 酶為寶生物工程(大連)有限公司產品;胰蛋白胨、酵母提取物為OXOID 公司產品;三羥甲基氨基甲烷(Tris)購于GE Health Care 公司;十二烷基磺酸鈉(SDS)、EB、苯酚、瓊脂糖購于Sigma公司;其他試劑均為國產分析純。

1.2 cDNA 文庫的構建

由本研究組采用SMART 技術構建中國蛇島蝮蛇毒腺的cDNA 文庫［19］。

1.3 cDNA 克隆的序列測定

1.3.1 cDNA 文庫菌液的擴增

cDNA 文庫進行梯度實驗，選出最佳稀釋濃度后，在LB 固體培養(yǎng)基(34 μg/mL 氯霉素)上涂板，每個平板的理論細菌個數(shù)為960，37 ℃倒置培養(yǎng)16 h;然后挑取單個菌落至3 mL LB 液體培養(yǎng)基中(34 μg/mL 氯霉素)，37 ℃震蕩培養(yǎng)16 h;然后在10000 rpm 離心1 min，棄上清，細胞沉淀盡可能干燥，–20℃保存。

1.3.2 cDNA 文庫質粒的提取

采用堿裂解法提取質粒:(1)將細菌沉淀懸浮于200 μL 預冷至4 ℃的溶液Ⅰ中(1M Tris-HCl，0.5 M EDTA，20% glucose，pH 8.0)，劇烈震蕩，室溫放置5 min;(2)加入400 μL 溶液Ⅱ(0.4 M NaOH，2%SDS)，快速輕顛倒5 次混勻，室溫靜置5 min;(3)加入300 μL 溶液Ⅲ(29% KAC，11% CH3COOH，pH 4.8)，輕顛倒數(shù)次混勻，冰上放置5 min 后在4 ℃、1000 rpm 下離心5 min;(4)小心吸出上清，加入與上清液等體積的苯酚-氯仿混合液抽提，顛倒混勻，冰上放置5 min 后在4 ℃、10000 rpm 下離心2 min;(5)小心吸出上層水相，加入2 倍體積無水乙醇，混勻，室溫放置5 min 后離心(5 min，4 ℃，10000 rpm);(6)棄上清，傾去液體，加入1 mL 0 ℃70%乙醇洗滌沉淀，吹打后離心(2 min，4 ℃，10000 rpm);(7)棄上清，乙醇揮發(fā)干凈后，每個質粒加入30 μL TE(1M Tris-HCl，0.5 M EDTA，20 μg/mL RNase，pH 8.0)緩沖液溶解，-20 ℃保存。取0.5 μL 樣品，采用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定質粒提取結果。

1.3.3 cDNA 克隆的序列測定

隨機挑選216 個cDNA 單克隆進行測序。設計通用引物M13F 序列5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'，對單克隆進行5'端單向測序。反應體系總體積為20 μL:8 μL DYEnamic ET Dye Terminator reagent premix (Amersham Pharmacia，USA)，1 μL 5 μmol/L M13 F，質粒模板0.2～2 μg。PCR 測序反應條件為:95 ℃20 s，50 ℃15 s，60 ℃1 min，進行30 個循環(huán)，測序用MegaBACETM1000 DNA 測序儀(Amersham Pharmacia，USA)完成。

1.3.4 ESTs 序列分析

獲得的cDNA 質粒序列用Chromas 剔除pDNRLIB 載體序列以及包含的接頭序列，并去除冗余序列，得到每個克隆的EST 序列信息;然后通過Stackpack 軟件將獲得的序列進行拼接，獲得unigenes，由重疊群(contigs)及單一序列(singlets)組成，通過NCBInr 數(shù)據(jù)庫進行Blast X 檢索和序列比對及功能分析，根據(jù)蛋白相似性推測基因功能并分類。

2 結果與討論

2.1 cDNA 文庫質量分析

我們前期以pDNR-LIB 為載體，構建了我國第一個GSSG-cDNA 文庫，其原始文庫庫容量為8 ×107cfu/mL。隨機從文庫中挑選單菌落進行菌液PCR 鑒定結果表明:大多數(shù)插入片段均大于1000 bp，表明所構建的GSSG-cDNA 文庫質量很高［19］。

2.2 cDNA 文庫質粒鑒定

用堿裂解法提取文庫質粒，經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，圖1 顯示了部分cDNAs 的質粒提取電泳圖。cDNA 文庫質量直接影響其使用價值。評價一個cDNA 文庫質量，主要是看該cDNA 文庫的庫容量和重組cDNA 片段的序列完整性［20］。電泳結果顯示大多數(shù)重組質粒分子量大于3000 bp，進一步表明我們構建的GSSG-cDNA 文庫是完整高質量的，獲得全長序列的可能性大，可滿足EST 研究要求。為今后利用該文庫進行大規(guī)?；蚝Y選、獲得有價值的功能基因奠定了基礎。電泳圖上發(fā)現(xiàn)提取的質粒伴有不同程度開環(huán)現(xiàn)象，但并不影響后續(xù)的序列分析。

圖1 GSSG-cDNA 文庫質粒瓊脂糖凝膠電泳(1%)Fig.1 Agarose gel electrophoresis (1%)of GSSG-cDNAs

2.3 ESTs 序列分析

隨機選取GSSG-cDNA 文庫中的216 個單克隆進行5'單向測序，獲得有效序列211 條，即211 個ESTs，測序成功率為97.7%。

EST 包含了完整基因上能夠特異性標記基因的部分序列，通常包含了基因足夠的信息區(qū)，從而可與其它基因相區(qū)分。將ESTs 序列與數(shù)據(jù)庫中存儲的基因/蛋白序列進行比對和相似性分析，可確定出哪些EST 為已知基因，哪些EST 為未知基因［21，22］。211 條高質量GSSG-ESTs 經Blast X 檢索NCBInr 數(shù)據(jù)庫比對、查詢和注釋(E≤10-6)表明:(1)84 條ESTs 與數(shù)據(jù)庫中有序列注釋的已知功能蛋白具有一定同源性，為已知功能基因，占39.8%;(2)29 條ESTs 與有序列注釋的未知功能蛋白具有同源性，為未知功能基因，占13.7%;(3)98 條ESTs 是數(shù)據(jù)庫中無注釋信息的序列、僅有很低同源性或在數(shù)據(jù)庫中未搜索到序列，即新基因，占46.5%，說明蛇島蝮蛇具有自己的特異基因(圖2，表1)。

圖2 GSSG-cDNA 文庫ESTs 比對結果Fig.2 The blasting results of ESTs of GSSG-cDNA library

組織中一定數(shù)量的ESTs 可代表該組織中基因表達情況，隨機測序所獲得的同一基因的EST 數(shù)目在一定程度上代表該基因在該組織中的表達豐度。一個基因的表達次數(shù)越多，能夠測到的相應EST 也越多，因此通過EST 分析可以了解基因表達情況和表達豐度［16］。一般把表達頻率＜2 的基因視為低表達豐度基因;表達頻率≥2 且＜5 的基因視為中表達豐度基因;表達頻率≥5 的基因視為高表達豐度基因［16，21，22］。GSSG 的211 個ESTs 代表130 個unigenes，包括16 個singlets 和114 個contigs。文庫平均冗余率12.3%，其中高表達豐度基因7 個，占全部unigenes 的5. 4%;中表達豐度基因9 個，占6.9%;低表達豐度基因114 個，占87.7% (圖3，表1)，GSSG-cDNA 文庫大多數(shù)基因呈低豐度表達，這樣可避免重復測序，獲得單一基因的幾率大大增加，避免人力物力的浪費。

圖3 GSSG-cDNAs 基因表達豐度分布Fig.3 The gene expression abundances of GSSG-cDNA

表1 GSSG-cDNA 文庫部分cDNA Blast 檢索結果Table 1 Blasting results of GSSG-cDNAs

elongation factor-1 alpha Pelodiscus sinensis 86% 2 7 Splicing factor SLU7 Monodelphis domestica 82% 1 8 ribosomal protein L23a Salmo salar 75% 1 9 calnexin Gallus gallus 83% 1 10 phosphatase 2 Taeniopygia guttata 90% 1 11 zinc finger Sus scrofa 73% 1 12 adenylosuccinate synthetase Gallus gallus 85% 1 13 Bax inhibitor-1 Canis familiaris 76% 1 14 cyclin C Gallus gallus 89% 1 15 ribosomal protein L5 Gallus gallus 83% 1 16 GTP-binding protein SAR1b-like Callithrix jacchus 86% 1 17 Adapter-related protein complex 3 delta 1 Taeniopygia guttata 85% 1 18 lysosomal acid lipase Macaca mulatta 60% 1 18 PSEN2 gene for presenilin 2 Homo sapiens 78% 1 20 transketolase Gallus gallus 83% 1 21 NNU 95048 12S ribosomal RNA gene Gloydius intermedius shedaoensis 94% 1 22 membrane protein 1 Monodelphis domestica 80% 1 23 cell division cycle and apoptosis regulator 1 Ailuropoda melanoleuca 86% 1 24 alpha actin Atractaspis microlepidota microlepidota 97% 1 25 dehydrogenase Ornithorhynchus anatinus 82% 1 26 Rho GTPase activating protein 5 Taeniopygia guttata 85% 1 27 member RAS oncogene family Gallus gallus 78% 1 28 arginine-rich Monodelphis domestica 62% 1 28 cellular nucleic acid binding protein Gallus gallus 78% 1 30 cysteine dioxygenase Gallus gallus 78% 1 31 ubiquitin-fold modifier 1 Gallus gallus 86% 1 32 Ribosomal protein S6 kinase Gallus gallus 86% 1 33 tetraspan NET-6 Monodelphis domestica 75% 1 34 gamma-actin mRNA Trichosurus vulpecula 84% 1 35 programmed cell death 4 Ailuropoda melanoleuca 80% 1 36 ribonuclease UK114-like Ailuropoda melanoleuca 80% 1 37 tRNA selenocysteine-associated protein 1 Taeniopygia guttata 81% 1 38 Ubiquitin-conjugating enzyme E2 G2 Rana catesbeiana 83% 1 39 serine palmitoyltransferase Gallus gallus 71% 1 40 eukaryotic translation initiation factor 1A Taeniopygia guttata 88% 1 41 constitutive photomorphogenic protein Gallus gallus 90% 1 42 predicted protein Postia placenta Mad-698-R 90% 1 43 KIAA0987 protein (LOC100015377) Monodelphis domestica 70% 1 44 RP23-157G2 from chromosome 5 Mus musculus BAC 85% 1 45 hypothetical protein LOC100227078 Taeniopygia guttata 84% 1 46 E33DIFJ02GS9NC microsatellite sequence Agkistrodon contortrix 84% 1 47 E33DIFJ02F7Q1J microsatellite sequence Agkistrodon contortrix 80% 1 6

1-41:已知功能基因;42-55:未知功能基因;56-61:新基因，其余92 條ESTs 在數(shù)據(jù)庫中未能搜索到同源蛋白，沒有列出。1-41:genes with known function;42-55:genes with unknown function;56-61:new genes，the rest 92 ESTs were not listed due to had no significant matches to any protein sequences in the public database

在Blast X 分析中，我們獲得了一部分已知功能基因，這些基因具有重要的生物學功能;因此，可以根據(jù)獲得的序列來設計引物，克隆、表達目的活性蛋白組分，進一步研究其生物學活性。例如我們得到一個GSSG 基因，其EST 序列為648 bp(圖4 A)，編碼216 個氨基酸(圖4 B)，氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)其與非洲家蛇和水游蛇的轉鐵蛋白同源性高達84%(圖4 C)。但轉鐵蛋白在蛇毒中扮演的角色以及具體生物學活性，目前尚不清楚。

圖4 蛇島蝮蛇轉鐵蛋白序列分析Fig.4 The sequence analysis of GSS-transferrin

此外有近60%的GSSG 基因為新基因或未知功能基因，說明在GSS 中存在自身含有的特異基因/蛋白，提示我們去搞清楚:1)它們是什么基因/蛋白，2)它們在GSS 中起什么作用，3)它們有什么具體應用和生物功能，亟須進一步研究去揭示，是今后研究的重點。例如，本研究發(fā)現(xiàn)一個GSSG 基因，其全長序列為384 bp:

ATGGGGCAGGATGAAATTAGCAACTTCACTGA CTTAGCCTTGCAATATTATAACCAGCAGGAAGAG TCCCTGTTTATACCTTTGAAGAACACAACCGTGA CGGTCAAGAAAGCCATTGGATCCATATTGGGC CTGCCGATGATTGTGGAAAGGACCAACTGCACC AAAAAAGATGTGAAACGACATTTTAGGAGTC CCTTTGATTCTGAAGAAGAACCCCGGAAATATTG TATGCCGCTTCCGGACCCTGAGCAACTGAACT GCAAATTTCACATTTTTAAAGATGAAAGGACTT ACAGCGAAGCTATACTGGGCCATGAATGCGA GCCAATTAAAATAATCGATAAGGAGATTCTT AATGTTGAAGATACAAAATCACCATAT，編碼128 個氨基酸。序列比對發(fā)現(xiàn)其與抗輻射不動桿菌的一個假設蛋白有8%序列同源性，但這個GSSG 基因具體是什么基因，有什么樣的生物學功能，在GSS 中起什么作用，需要和值得進一步研究。

近年來，隨著激光顯微切割、cDNA 文庫標準化、DNA 自動測序技術和cDNA 芯片技術的快速發(fā)展，使得隨機挑取cDNA 單克隆進行大規(guī)模測序得以順利進行，并為克隆新基因、尋找組織特異性基因等提供了快速有效的方法［21，22］。用EST 代替基因組測序，可使研究費用大大降低，同時效率大大提高，因為EST 能大大縮小基因篩選范圍，提高分離基因的效率。在生物體內表達基因只占整個基因組的3%～5%，而EST 反映的是表達基因的編碼部分，故通過EST 可直接獲得基因表達信息。一旦發(fā)現(xiàn)有價值的EST，可通過PCR 技術獲得全長cDNA序列，并克隆、表達目的基因。由于EST 在分析研究功能基因組方面具有的明顯優(yōu)越性，已被廣泛用于新基因的克隆、基因表達譜分析、基因差異表達以及基因組序列的功能注釋等諸多研究領域。

總之，本實驗在我們成功構建中國蛇島蝮蛇毒腺全長cDNA 文庫基礎上，獲得了211 條ESTs 序列，其中84 個為已知功能基因，29 個為未知功能基因，98 個為新基因。盡管本次所測ESTs 序列不太多，但已經提示所得結果可能代表整個蛇毒基因的表達情況，其中低豐度表達基因占總GSSG 基因的近90%，說明采用我們所構建的GSSG-cDNA 文庫，將來進行GSS 基因大規(guī)模篩選和鑒定時，可避免重復測序，獲得單一基因的幾率很大，便于發(fā)現(xiàn)更多的、有價值的功能基因以開展后續(xù)研究，可有效避免人力物力的浪費。

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