向招燕，李濤，余明華，李亞

動脈導管未閉( patent ductus arteriosus，PDA) 是常見的先天性心臟病之一，大約占先天性心臟病的7% ～10%［1］。在足月兒中，其發(fā)病率為1/2000，男女比例為1:2［2］; 早產兒動脈導管未閉的發(fā)生率較足月兒高，可達20%左右［3］;且胎齡和體重越小，發(fā)病率越高［4］。PDA 若未及時治療，?？烧T發(fā)和促進慢性肺疾病、顱內出血、心力衰竭等疾病，是影響早產兒致殘率和死亡率的重要因素之一。但到目前為止，動脈導管未閉的機制尚不十分明確。有研究顯示其與遺傳、缺氧、離子通道( 氧敏感性鉀通道) 、血管活性物質( 前列腺素、內皮素、血栓素) 等因素有關［5-7］。近年來，我們課題組研究表明氣體網絡分子系統(tǒng)［一氧化氮( NO) 、一氧化碳( CO) 、硫化氫( H2S) ］中的NO 和H2S 存在于動脈導管組織中，并且在PDA 的發(fā)病機制中起到一定的作用［8］;亦有研究表明CO 在心血管系統(tǒng)中的功能與NO 相似，可以舒張血管，降低血管對收縮介質的反應。NO 在動脈導管的舒張與收縮中發(fā)揮著作用，所以我們推測如果動脈導管中存在CO 的表達，那么可能CO 也在動脈導管的舒張與收縮中發(fā)揮著與NO 相似的功能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 胎齡30 d 的日本大耳白兔孕兔( 由湖北醫(yī)藥學院實驗動物中心提供) ，體重2.5 ～5 kg，實驗動物許可證號:SYXK( 鄂)2011-0031。

1. 2 主要試劑 Trizol 試劑( Life Technologies，美國) ;逆轉錄試劑盒( Fermentas，美國) ;2* Taq PCR MasterMix( 天根生化科技，北京) ; 熒光定量PCR 試劑盒( Fermentas，美國) ;DL 1000 DNA Marker( TaKa-Ra，大連) ;實時熒光定量PCR 引物序列:HO-2 引物序列上游引物: 5＇-AGC AGC ATA GTA GGG GCA TTT-3＇下游引物:5＇-ACC TGA ACC TGA AGA CCA AAG A-3＇，GAPDH 引物序列上游引物:5＇-GGT GGT CTC CTC TGA CTT CAA CA-3＇ 下游引物: 5＇-GGT GCT GTA GCC AAA TTC GTT GT-3＇，引物均由上海生工生物工程;RIPA 裂解液( 強) ( Beyotime，上海) ;BCA 蛋白質定量試劑盒( 天根生化科技，北京) ; 一抗兔抗兔HO-2( abcam，美國) ; 內參小鼠抗兔B-actin( Beyotime，上海) ;二抗辣根過氧化物酶標記山羊抗兔( 鼎國，北京) ;Prestained Protein ladder( Fermentas，美國) ;內源性一氧化碳試劑盒( 南京建成) ; 其余試劑為國產市售分析純試劑。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組 4 只孕齡為30 d 的的日本大耳白兔，共產下24 只足月的仔兔( 平均每只產仔6 只) ，產下的仔兔立即固定于工作臺上，在無菌的條件下，分別取出仔兔動脈導管組織(－80℃保存) 和新鮮心臟血，做好標記，備用。

1.3.2 仔兔動脈導管組織中HO-2 mRNA 表達水平的檢測 TRIzol 法抽提動脈導管中HO-2 mRNA，BioPhotometer plus 核酸蛋白測定儀檢測所提mRNA的濃度及純度( 總RNA OD260/OD280 均介于1.7 ～2.0 之間說明提取的總RNA 質量純，這也保證后面熒光定量PCR 實驗的可靠性及可重復性) ，兩步法逆轉錄成cDNA 后進行RT-PCR 和實時熒光定量PCR 法檢測。所用引物均由上海生物工程有限公司合成。RT-PCR 反應體系( 25μl 體系) : 按天根生化科技提供的步驟程序進行操作，并設內參對照( 內參引物為GADPH) 。擴增條件: 按天根生化科技提供的步驟程序進行操作，退火溫度58℃，其他條件不變。在Biometra Tpersonal 型擴增儀上擴增，Touching 凝膠系統(tǒng)上分析結果。SYBR 熒光定量PCR 反應體系(25μl 體系) :qPCR Master Mix(2X)12.5μL，Water nuclease-free10.5μL，cDNA1μL，上游引物0.5 μL，下游引物0. 5μL，并設內參對照( 內參引物為GADPH) 。擴增條件:按Fermentas 公司提供的程序進行操作，退火溫度58℃，其他條件不變。在ABI Prism 7500 型熒光定量PCR 儀上進行擴增并分析實驗結果。

1.3.3 仔兔動脈導管組織HO-2 蛋白表達水平的檢測 提取蛋白，BCA 法測定蛋白質濃度，計算蛋白上樣量，SDS-PAGE 電泳分離( 濃縮膠恒壓100 V，1 h;分離膠恒壓120 V，3 h) 、轉膜( PVDF 膜，恒壓18 V，2 h) ，室溫封閉1 h，分別依次加入一抗兔抗兔HO-2抗體(1:1000) ，內參小鼠抗兔β-actin 抗體(1:800) ，4℃緩慢搖動孵育過夜，振洗后加入二抗辣根過氧化物酶標記山羊抗兔(1:5000) ;室溫或4℃在側擺搖床上緩慢搖動孵育一小時。振洗完，顯色后SYNGENE上分析結果。

1.3.4 胎兔血漿一氧化碳含量測定 按照南京建成生物工程所有限公司提供的實驗步驟操作，最后帶入公式計算。計算公式為:

Hb( g/L) =540nm 處吸光度值× 367. 7; Hb-CO% =〔0.822 ×△OD( A568－A581) +0.001〕×100%; 全血中CO 含量( μmol/L) = HbCO% × Hb( g/L) ×106 ×4/64456

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 15.0 統(tǒng)計軟件進行分析，結果以均數±標準差(±s) 表示，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 仔兔動脈導管組織中HO-2 mRNA 和蛋白表達水平 如圖1 所示: 各條帶清晰，無二聚體，說明仔兔動脈導管組織中存在HO-2 mRNA 的表達。如圖2 所示:仔兔動脈導管組織中H0-2 蛋白的表達呈陽性，從蛋白水平再次證實動脈導管中存在HO-2 蛋白的表達。

圖1 動脈導管組織中HO-mRNA 凝膠電泳圖( 各條帶清晰可見，無二聚體，說明引物設計良好，1-4 條帶是HO-2 的表達，大小為182bp;5-8 條帶是內參GAPDH，大小為112bp，M 條帶為DNA Marker)

圖2 HO-2 的western blot 圖譜( 上面的條帶是內參β-action，大小是42kD;下面的條帶為HO-2 蛋白的圖譜，大小是36kD)

2.2 仔兔動脈導管組織中HO-2 mRNA 表達水平的實時熒光定量PCR 的結果 最終基因表達量用2-ΔΔCt 值表示，其中ΔΔCt =( HO-2mRNA Ct-GAPDH Ct) 實驗組-( HO-2mRNA Ct-GAPDH Ct) 空白組，其表達量為0.33 ±0.11。

2.3 胎兔血漿一氧化碳含量測定結果 胎兔心臟全血中內源性CO 的含量為53.09 ±6.73( μmol/L) 。

3 討論

CO 既往被認為是有毒的氣體，但近年來，大量研究證實CO 與NO 相類似，即可以舒張血管，降低血管對收縮介質的反應。目前為止，發(fā)現體內CO的來源中有兩條途徑，一條途徑是吸入的氣體中含有少量CO( 外源性CO) ;另一條途徑是體內生成的CO( 內源性CO) 。內源性CO 的產生至少有2 個途徑，大部分是在血紅素的代謝過程中產生的，即HO催化血紅素生成膽綠素、CO、Fe3+; 少量是通過微粒體脂質的過氧化產生，但對其作用機制尚不清楚。研究表明CO 對大鼠主動脈、肺動脈、尾動脈、冠狀動脈以及犬的股動脈、頸動脈、冠狀動脈等都可以直接調節(jié)血管平滑肌細胞的舒縮狀態(tài)。Johnson 等［9］通過測定脈管擴張流量和脈壓發(fā)現CO 減弱脈管系統(tǒng)的擴張流量。HO 為內源性CO 產生的限速酶，目前為止已經證明HO 具有三種形式的同工酶:HO-1，HO-2，HO-3。HO-1 不僅對金屬，而且對引起氧化應激和其它病理條件的所有刺激和化合物都十分敏感，Polizio 等［10］在果糖誘導的高血壓大鼠模型中發(fā)現HO-1 在器官抗氧化防御酶系統(tǒng)活性完好的情況下能發(fā)揮降低血壓作用。Zhu 等［11］通過試驗研究發(fā)現，CBS/H2S 和HO-1/CO 系統(tǒng)在心肌缺血再灌注中起協(xié)同保護作用。Ito 等［12］在轉基因小鼠模型中發(fā)現誘導HO-1 可增加IL-10 的產生而降低肺動脈高壓。Vera 等［13］發(fā)現HO-1 降低血管緊張素Ⅱ誘導的高血壓，并且減少超氧化物的產生。Coceani 等［14］采用免疫組織化學的方法對羊羔的動脈導管進行研究，發(fā)現血紅素加氧酶-1 在內皮細胞及平滑肌細胞上都有表達，而血紅素加氧酶-2 只在平滑肌細胞表達。近年研究顯示，肺血管平滑肌細胞和內皮細胞均有HO 蛋白及其活性的表達，是內源性CO 生成和釋放的重要場所之一。

動脈導管是一種特殊的血管，在出生后隨著肺呼吸、循環(huán)的建立，血氧張力提高，機體內前列腺素迅速降解、緩激肽釋放等各種因素作用，促使動脈導管關閉，而在這些因素中前列腺素E2( PGE2) 對維持動脈開放的作用最為重要［15］。Chang 等［16］對小鼠研究表明出生后前列腺素E2對動脈導管的關閉與否起著關鍵作用。我們課題組發(fā)現內源性H2S( 內源性氣體分子網絡中的一種) 不僅在大血管中能生成，而且在未出生的動物的動脈導管組織中也能產生，在動脈導管組織中有胱硫醚-γ-裂解酶基因表達。大量研究表明CO 在心血管系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用，與NO 類似，CO 也可以激活，升高胞漿中cGMP 水平，進而舒張血管。本研究證實了動脈導管中存在CO/HO-2，這為動脈導管的舒張與收縮機制的研究擴寬了領域。如果進一步的研究能證明CO在動脈導管的開放與關閉機制中發(fā)揮著作用，那么CO 是通過什么途徑舒張動脈導管的，這些內容還有待進一步的研究。

［1］ Mullins CE，Pagotto L. The Science and Pract ice of Pediatric Cardiology［M］. Edited by: Garson AJ，Bricker JT，Fisher DJ. Balt imore，Md:William s ＆ Wilkins，1998:1181-1197.

［2］ Giliberti P，De Leonibus C，Giordano L，et al. The physiopathology of the patent ductus arteriosus［J］. Matern Fetal Neonatal Med，2009，22( Suppl 3) :6-9.

［3］ Koehne PS，Bein G，Alexi-Meskhishvili V，et al. Patent ductus arteriosus in very low birth weisht infants:complications of pharmacological an dsurgical treatment［J］. J Perinat Med，2001，29( 4) :327-34.

［4］ 劉群，劉瑞霞. 吲哚美辛及布洛芬防治早產兒動脈導管未閉的進展［J］. 中國新生兒科雜志，2008，23(3) :189-192.

［5］ Forsey JT，Elmasry OA，Martin RP. Patent arterial duct［J］. Orphanet J Rare Dis，2009，(4) :17.

［6］ Schneider DJ，Moore JW. Patent duct arteriosus［J］. Circulation，2006，114(17) :1873-1882.

［7］ Hamrick SE，Hansmann G. Patent ductus arteriosus of the preterm infant［J］. Pediatrics，2010，125(5) :1020-1030.

［8］ 劉文龍，李濤，胡要飛. 硝普鈉對早產兔動脈導管胱硫醚-γ-裂解酶-硫化氫體系的影響［J］. 中華兒科雜志，2012，50( 2) :136-140.

［9］ Johnson RA，Johnson FK. Heme oxygenase derived endogenous carbon monoxide impairs flowin duced dilation in resistance vess els［J］. Shock，2008，29(4) :526-530.

［10］ Polizio AH，Gonzales S，Munoz MC，et al. Behaviour of the anti-oxidant defence system and heme oxygenase-1 protein expression in fructose-hypertensive rats［J］. Clin Exp Pharmacol Physiol，2006，33(8) :734-9.

［11］ Zh u JC，Shao JL，Ma H，et al. Interaction between endogenous cystathi on ine synthase/hydrogen sulf ide and heme oxygenase1/carbon monoxide systems durin gmyocardial ischemic reperfusion: experiment with rats［J］. Zhong hua Yi Xue Za Zhi，2008，88( 45) :3222-3225.

［12］ Ito T，Okada T，Miyashita H，et al. Interleukin-10 expression mediated by an adeno-associated virus vector prevents monocrotaline-induced pulmonary arterial hypertension in rats［J］. Circ Res，2007，101(7) :734-41.

［13］ Vera T，Kelsen S，Yanes LL，et al. HO-1 induction lowers blood pressure and superoxide production in the renal medulla of angiotensin II hepertensive mice［J］. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2007，292(4) :R1472-8.

［14］ Coceani F，Kelsey L，Seidlitz E，et al. Carbon monoxide formation in the ductus arteriosus in the lamb:Implications for the regulation of muscle tone［J］. Br J Pharmacol. 1997，120(4) :599-608.

［15］ Clyman RI，Brett C，Mauray F. Circulating prostaglandin E2 concentrations and incidence of patent ductus arteriosus in preterm infants with respiratory distress syndrome［J］. Pediatrics. 1980，66(5) :725-9.

［16］ Chang HY，Locker J，Lu R，et al. Failure of postnatal ductus arteriosus closure in prostaglandin transporter-deficient mice［J］. Circulation，2010，121(4) :529-36.