徐玉霞，王華斌

寶雞文理學(xué)院災(zāi)害監(jiān)測與機(jī)理模擬陜西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寶雞721013

海紅果學(xué)名西府海棠(Malus micromalus Makino)，屬于薔薇科(Rosaceae)梨亞科(Pomoideae)蘋果屬［1］。海紅果又名海紅子、子母海棠、小果海棠，在我國主要分布于晉、陜、蒙交界的三角地區(qū)，是一種稀有的地方果樹資源［2］。趙亮［3］、梁泰剛［4］等人研究發(fā)現(xiàn)海紅果富含黃酮類化合物。目前對海紅果的研究只停留在成分分析上［3-5］，而對海紅果中黃酮的提取、純化一直沒有相關(guān)文獻(xiàn)報道。

大孔吸附樹脂具有選擇性強(qiáng)、吸附容量大、吸附速度快、解吸容易、成本低等優(yōu)點(diǎn)［6］。何琦［7］、王婷婷［8］、李超［9］等人分別用大孔吸附樹脂純化植物黃酮，均取得較好的效果。本研究在進(jìn)行了提取海紅果總黃酮的研究基礎(chǔ)上，從10種大孔樹脂中篩選出對海紅果黃酮具有良好吸附和解吸性能的樹脂，考察了該樹脂對海紅果黃酮的靜態(tài)、動態(tài)吸附與解吸性能及主要影響因素，以期建立適宜的海紅果黃酮純化條件，為海紅果黃酮的提取、開發(fā)利用和提高附加值提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

海紅果(洗凈，自然陰干，50℃恒溫烘干，粉碎后過60目篩)產(chǎn)自陜西省府谷縣哈鎮(zhèn)。

蘆丁對照品中國藥品及生物制品檢定所;無水乙醇、正丁醇分析純，天津致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司;丙酮分析純，天津永晟精細(xì)化工有限公司;氫氧化鈉分析純，天津市北辰方正試劑廠;甲醇、鹽酸 分析純，西安化學(xué)試劑廠;硝酸鋁分析純，天津化學(xué)試劑三廠;亞硝酸鈉 分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;大孔吸附樹脂LSA-10、LSA-800、XDA-1、XDA-5，西安藍(lán)深公司;SP-207、SP-825，日本三菱化工; AB-8、D3520、NKA-9，南開大學(xué)化工廠;D-101，上海蘭季科技發(fā)展有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計TU-1810，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;電子天平AL-104，梅特勒-托利多上海儀器有限公司;超聲波藥品處理機(jī) JBT/CYCL400T/3P(D)，濟(jì)寧金百特工程機(jī)械有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-85C，上海青浦滬西儀器廠;循環(huán)水式多用真空泵SHB-Ⅲ，鄭州長城科工貿(mào)有限公司;高速臺式離心機(jī)TGL-10C，上海安亭科學(xué)儀器廠;恒溫振蕩培養(yǎng)搖床BS-1E，常州菲普實(shí)驗(yàn)儀器廠;精密酸度計PHS-3C，上海虹益儀器儀表有限公司;電熱恒溫水浴鍋HWS26，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總黃酮濃度的測定方法

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH體系絡(luò)合化學(xué)吸光法［10］，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

繪制方法參考文獻(xiàn)［11］和［12］。以吸光度(X)為橫坐標(biāo)，濃度(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為:Y=13.571X-0.009，R2=0.9992表明在該濃度范圍內(nèi)線性良好。

1.3.1.2 海紅果黃酮濃度的計算

將海紅果提取液定容至100 mL后，取1 mL置于10 mL的具塞試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線制作方法測定樣品反應(yīng)液在508 nm波長下測其吸光值，用回歸方程計算黃酮濃度ρA。海紅果黃酮濃度按(1)式計算:

黃酮濃度ρ(mg/mL)=ρA×n(1)

其中:ρA(mg/mL)—與提取液吸光度值對應(yīng)的海紅果黃酮濃度(mg/mL)，n—稀釋倍數(shù)。

1.3.2 海紅果黃酮粗提液的制備

將新鮮海紅果經(jīng)過干燥、粉碎、過60目篩后稱取20 g，加入60%的乙醇溶液500 mL，在40℃，功率為360 W，頻率為42 kHz的超聲波藥品處理機(jī)中提取30 min，2500 rpm離心10 min，過濾后取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)回收溶劑，即為海紅果黃酮粗提液。

1.3.3 大孔吸附樹脂的預(yù)處理

將1.1中10種大孔吸附樹脂用無水乙醇室溫下密封浸泡24 h，用蒸餾水洗至洗出液加蒸餾水不顯渾濁為止。然后用l mol/L NaOH溶液浸泡8 h，蒸餾水洗至中性，再用l mol/L鹽酸浸泡8 h，用蒸餾水洗至中性。

1.3.4 樹脂的篩選

預(yù)處理好的10種大孔吸附樹脂用濾紙吸干表面的水分，分別稱取5.000 g置于250 mL三角瓶中，分別加入濃度為5.15 mg/mL的海紅果黃酮粗提液100 mL，并調(diào)整溶液的pH值為5.0。將三角瓶用保鮮膜封口，放入30℃，150 rpm的搖床中振蕩，每隔l h測一次三角瓶內(nèi)上清液中黃酮濃度，持續(xù)測24 h。再將經(jīng)靜態(tài)飽和吸附后的樹脂抽濾出，用濾紙吸干表面水分，加入80%乙醇100 mL，并放入相同環(huán)境下的搖床中振蕩，同樣每隔l h測一次三角瓶內(nèi)洗脫液中黃酮濃度，持續(xù)測24 h。依下式分別計算吸附量、吸附率、解吸量、解吸率、黃酮收率和純度。從中篩選出性能最優(yōu)的大孔吸附樹脂。

其中:ρ0—海紅果黃酮粗提液中黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL)，ρs—吸附后上清液的黃酮質(zhì)量濃度(mg/ mL)，V0—海紅果黃酮粗提液的體積(mL)，ρd—洗脫液的黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL)，Vd—洗脫液的體積(mL)，W—樹脂質(zhì)量(g)，Wd—洗脫液液濃縮烘干后固形物的質(zhì)量(mg)。

1.3.5 大孔樹脂動態(tài)吸附條件的優(yōu)化

將最優(yōu)樹脂按1.2.3方法先進(jìn)行預(yù)處理，濕法裝入Ф2.0 cm×30.0 cm的層析柱中，裝柱高度約為20 cm。再分別考察上柱液pH值、上柱液濃度、上柱液流速和上樣量對吸附效果的影響。

1.3.6 大孔吸附樹脂洗脫條件的優(yōu)化

分別考察不同種類和濃度的洗脫劑，洗脫液用量和洗脫流速對洗脫效果的影響。

1.3.7 樹脂重復(fù)使用周期的考察

為了考察樹脂的穩(wěn)定性及抗污染性，按照最優(yōu)的吸附和洗脫條件，取海紅果黃酮粗提液反復(fù)進(jìn)行上柱、吸附、洗脫，在同一根樹脂柱上重復(fù)操作10次，分別測定吸附液和解吸液黃酮濃度，并計算吸附率、解吸率和黃酮收率。

1.3.8 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照最優(yōu)的吸附和洗脫條件，取海紅果黃酮粗提液反復(fù)進(jìn)行上柱、吸附、洗脫，分別測定吸附液和解吸液黃酮濃度，做五組平行試驗(yàn)，計算吸附量、吸附率、解吸量、解吸率、黃酮收率和純度。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹脂的篩選

10種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附和解吸試驗(yàn)各24 h后結(jié)果如表1所示。10種大孔吸附樹脂對海紅果黃酮的吸附量和解吸量均有不同。其中NKA-9、SP-825和SP-207的吸附量較大，分別為165.41、151.90和143.77 mg/g。這三種樹脂的黃酮收率和純度也較高，黃酮收率分別為68.31%、59.87%和61.73%。純度分別為28.50%、25.65%和25.04%。這可能是因?yàn)楹＜t果黃酮類化合物分子較大，NKA-9、SP-825和SP-207均具有較大的孔徑。同時，由于大孔樹脂的吸附原理主要為物理吸附，比表面積越大，表面張力隨之增大，吸附量就會提高。

表1 10種大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附與解吸數(shù)據(jù)Table 1 Static adsorption-desorption properties of 10 resins

由表1可知，NKA-9大孔吸附樹脂無論從吸附能力還是解吸能力都優(yōu)于其他樹脂，因此選擇NKA-9大孔吸附樹脂做為最優(yōu)的海紅果黃酮純化樹脂。

2.2 大孔樹脂動態(tài)吸附條件的優(yōu)化

2.2.1 上樣液pH值的選擇

將體積為4 BV，質(zhì)量濃度為5.15 mg/mL的海紅果黃酮粗提液的pH值分別調(diào)節(jié)為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，以約2.0BV/h的流速過柱。試驗(yàn)結(jié)果如圖1所示，偏酸性環(huán)境有利于海紅果黃酮的吸附。上樣液pH值為4.0時NKA-9樹脂的吸附率最大，達(dá)到了79.78%，這是由于在弱酸性條件下，具有酚羥基結(jié)構(gòu)的黃酮均以分子狀態(tài)存在，可以憑借范德華力與樹脂發(fā)生物理吸附作用［13］。因此最優(yōu)的上樣液pH值為4.0。

2.2.2 上樣液濃度的選擇

將海紅果黃酮粗提液初始濃度分別控制在2.85、4.00、5.15、6.30、7.45 mg/mL，其余條件按照2.2.1 進(jìn)行動態(tài)吸附。結(jié)果如圖2所示，濃度在低于5.15 mg/mL的區(qū)間內(nèi)，海紅果黃酮吸附率都隨著上樣液濃度增大而增大，但高于5.15 mg/mL后黃酮吸附率又有所降低。這是因?yàn)闈舛冗^低，上柱液通過柱床速度大于傳質(zhì)速度。但上樣液濃度過大時，海紅果黃酮向樹脂內(nèi)部擴(kuò)散速度減慢，而且容易使過飽和而成為糊狀，堵塞樹脂孔隙而影響吸附和解吸［14］。因此，上樣液粗提液濃度為5.15 mg/mL是較適宜的濃度，吸附率可達(dá)79.48%。

圖1 上樣液pH值對吸附效果的影響Fig.1 Effects of sample pH value on adsorption

圖2 樣液濃度對吸附效果的影響Fig.2 Effects of sample concentration on adsorption

2.2.3 上樣液流速的選擇

設(shè)定上柱液流速分別為1、2、3、4、5 BV/h，其余條件按照2.2.1進(jìn)行動態(tài)吸附。結(jié)果由圖3可知，當(dāng)上樣液流速為1 BV/h時，NKA-9樹脂的吸附率最高，為81.71%。隨著流速的增加，吸附率逐漸降低。這主要是因?yàn)樯蠘右毫魉僭铰?，海紅果黃酮物質(zhì)能充分?jǐn)U散到樹脂的內(nèi)表面，從而吸附的越完全。而上樣液流速過大時，海紅果黃酮還未能擴(kuò)散到樹脂的內(nèi)表面，就會沖出柱子，從而造成吸附量下降。在實(shí)際操作中，流速過低又會影響到生產(chǎn)效率，會使生產(chǎn)周期延長，提高生產(chǎn)的成本。綜合考慮，上樣液流速以2 BV/h較為適宜，吸附率為79.92%。

圖3 流速對吸附率的影響Fig.3 Effect of flow rate on adsorption capacity

2.2.4 上樣量的選擇

加入大于30倍床體積的海紅果黃酮粗提液上柱，其他條件同2.2.1，分步收集漏出液(每管收集1 BV)，檢測漏出液黃酮含量，以上樣液的體積為橫坐標(biāo)，漏出液黃酮濃度為縱坐標(biāo)，繪制動NKA-9樹脂態(tài)穿透吸附曲線如圖4所示。當(dāng)流出液的黃酮質(zhì)量濃度達(dá)到其上樣液的10%時即認(rèn)為黃酮已穿透。上樣液濃度為5.15 mg/mL時的黃酮穿透點(diǎn)為3 BV，而漏出液體積為10 BV后NKA-9樹脂達(dá)到了飽和吸附狀態(tài)。從圖4也可以看出，上樣量越少，漏出液體積也會越小，漏出液黃酮濃度越低，吸附率越高。但上樣量過多，不僅會使純化周期將延長，工作效率降低，而且會影響黃酮總收率。綜合考慮，選擇上樣量為4BV為宜。

圖4 NKA-9樹脂動態(tài)穿透吸附曲線Fig.4 Curve of dynamic breakthrough adsorption of NKA-9 resin

2.3 大孔吸附樹脂洗脫條件的優(yōu)化

2.3.1 洗脫劑的選擇

分別將100 mL甲醇、無水乙醇、丙酮、正丁醇及體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%的乙醇水溶液加入到含5.000 g飽和吸附樹脂的三角瓶中，其他條件同1.2.4。24 h后測得不同的洗脫劑對海紅果黃酮的洗脫效果如表2所示。其中丙酮的解吸率和黃酮收率最高為84.90%和70.38%，其次是體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇水溶液，解析率和黃酮收率分別為82.74%和68.59%。考慮安全性和成本因素，選擇80%乙醇溶液做洗脫劑。

表2 不同洗脫劑對海紅果黃酮的洗脫效果Table 2 Desorption efficiency of different solvent on M.micromalus flavonoids

2.3.2 洗脫液用量的選擇

按1.2.5中確定的最優(yōu)吸附條件進(jìn)行上柱，吸附之后，用1 BV蒸餾水快速淋洗樹脂柱以除去蛋白質(zhì)、多糖等水溶性雜質(zhì)。用80%乙醇溶液，流速為1 BV/h進(jìn)行洗脫。分部收集洗脫液(每管收集 1 BV)，檢測黃酮含量，以洗脫液體積為橫坐標(biāo)，解吸液黃酮濃度為縱坐標(biāo)，繪制動態(tài)解吸曲線如圖5所示。洗脫液用量在2 BV以內(nèi)時，洗脫液中黃酮濃度隨洗脫液用量增大而升高，用量大于2 BV后又隨之降低，洗脫峰相對集中且無拖尾。考慮到生產(chǎn)成本，因此選擇洗脫液的用量為3 BV，解析率達(dá)84.66%。

圖5 NKA-9樹脂動態(tài)解吸曲線Fig.5 Dynamic elution curve of NKA-9 resin

2.3.3 洗脫液流速的選擇

洗脫液用量為3 BV，洗脫流速分別控制在0.5、1、1.5、2、2.5 BV/h，其他操作方法與條件同2.3.2。試驗(yàn)結(jié)果如圖6所示，洗脫液流速越快，洗脫率越低。其中流速為0.5 BV時，解吸率達(dá)到86.95%，而流速為2.5 BV時，解吸僅有44.75%。但流速太慢會使操作時間延長，工作效率降低。因此本試驗(yàn)將洗脫液流速控制在1 BV/h為宜，解析率為84.36%。

圖6 洗脫液流速對洗脫效果的影響Fig.6 Effect of elution rate on elution efficiency

2.4 樹脂重復(fù)使用周期的考察

NKA-9樹脂重復(fù)使用周期結(jié)果如表3所示。經(jīng)過10個周期的反復(fù)吸附與洗脫，吸附率和黃酮收率逐漸降低，而解析率變化不大。其中第8次使用海紅果黃酮的吸附率明顯下降，從69.96%下降到62.87%。說明NKA-9樹脂重復(fù)使用7次后，需要進(jìn)行再生。再生時只需用丙酮和水交替洗滌多次即可［15］。

表3 NKA-9樹脂重復(fù)使用9個周期的性能變化Table 3 Adsorption properties change of NKA-9 resin on repeat use 9 cycles

6 71.17 80.73 57.09 7 69.96 78.95 53.20 8 62.87 79.36 48.78 9 56.37 80.23 42.54 10 49.80 77.35 39.41

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

按照上述所確定的最優(yōu)的純化海紅果黃酮的吸附和洗脫條件，重復(fù)試驗(yàn)五次，測得海紅果黃酮的吸附率、解析率、收率、純度的平均值分別為(79.39± 0.13)%，(84.14±0.11)%，(68.20±0.15)%和(28.81±0.06)%。

3 結(jié)論

NKA-9樹脂對海紅果黃酮有很好的吸附和解吸性能，為海紅果黃酮純化的最優(yōu)樹脂，其最優(yōu)的動態(tài)吸附工藝條件為:上樣液pH值為4.0，濃度5.15 mg/mL，上樣量為4 BV，流速為2 BV/h。最優(yōu)的洗脫工藝條件為:洗脫劑為80%乙醇溶液，洗脫液用量為3 BV，洗脫流速為1 BV/h。在此優(yōu)化條件下，海紅果黃酮的吸附率、解析率、收率、純度的平均值分別達(dá)到為(79.39±0.13)%，(84.14±0.11)%，(68.20±0.15)%和(28.81±0.06)%(n=5)。NKA-9樹脂可重復(fù)使用7次。

1 Bao ZH(鮑智鴻)，Hu XS(胡小松).Study on process and formula of Malus micromalus Makino tea(dried).Chin Agric Sci Bull(中國農(nóng)學(xué)通報)，1999，(4):34-36.

2 He XL(賀學(xué)林).The development and utilization of Malus micromalus Makino trees resources.Northern Horticulture(北方園藝)，2003，1(4):32.

3 Zhao L(趙亮)，Liu EL(劉恩荔)，Li QS(李青山)，et al.Content determination of total flavonoids in fruit of Malusmicromalus by ultraviolet spectrophotometry.J Shanxi Med Univ (山西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報)，2006，37:169-171.

4 Liang TG(梁泰剛)，Liu EL(劉恩荔)，Zhao CX(趙承孝)，et al.Simultaneous determ ination of four flavonoids in Malus prunifolia from Shanxi province by RP-HPLC.Chin J Chin Mater Med(中國中藥雜志)，2009，34:2217-2219.

5 Zhao L(趙亮).Preliminary study on pharmaceutical value of Malus micromalus Makino.Taiyuan:Shanxi Medical University(山西醫(yī)科大學(xué))，PhD.2006.

6 He W，Li W.Application of macroporous absorbed resin in separation and purification of traditional Chinese medicine.J Nanjing Univ Trad Chin Med(南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報)，2005，21:134-136.

7 He Q(何琦)，Ji YQ(及元喬)，Ding LS(丁立生)，et al.Study on D140 macroreticular adsorbent adsorption properties for flavonoid glycosides from Ginkgo biloba L..Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2001，13:56-59.

8 Wang TT(王婷婷)，Cao SW(曹樹穩(wěn))，Yu HY(余燕影)，et al.Adsorption and Separation of Total Flavones from Millettla nitida var.hirsutissima by Macroporous Adsorption Resin.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2008，20: 477-481.

9 Li C(李超)，Wang NX(王乃馨)，Zheng Y(鄭義)，et al.Using AB-8 macroporous adsorption resin for separation and purification of total flavonoids from Stenoloma chusana(L.) Ching.Food Sci(食品科學(xué))，2011，32(16):31-35.

10 Song LH(宋立華)，Zheng YR(鄭遠(yuǎn)榮)，Sun XJ(孫向軍)，et al.Research on the extraction of flavone from cactus by ultrasonic.J Shanghai Jiao Tong Univ，Agric Sci(上海交通大學(xué)學(xué)報，農(nóng)科版)，2008，26(1):70-73.

11 Zhang B(張斌)，Jiang LK(蔣立科)，Wang HM(王紅梅).Study on extraction technology of total flavonoids from Leaves of Magnclia Grandiflora.Chemistry＆Bioengineering(化學(xué)與生物工程)，2009，(5):32-34.

12 Zhang YJ(張意靜).Food Analysis Technology.Beijing:China Light Industry Press，2001.

13 Li BT(李伯廷)，Wang X(王湘)，Li XJ(李小進(jìn)).Application of macroporous absorbed resin in separation and purification of natural product.Chin Tradit Herb Drugs(中草藥)，1990，21(8):42-44.

14 Jing Y(景怡)，Jing RQ(景榮琴)，Ren Y(任遠(yuǎn))，et al.Study on the separation and purification the total flavonoids in the stigma maydis by AB-8 macroporous absorption resins.Acta Chin Med Pharm(中醫(yī)藥學(xué)報)，2010，38:75-78.

15 Liang SL(梁少玲)，Cai Y(蔡宇)，Yang YX(楊燕霞).Application of macroporous absorbed resin in separation and purification of flavonoids and saponin.LiShiZhen Med Mate Med Res(時珍國醫(yī)國藥)，2006，17:277-278.